Structure-function relationships in transmembrane transporters

Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που πραγματοποιούν την επιλεκτική μεταφορά ουσιών μέσω των μεμβρανών. Τα μέλη της οικογένειας μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter family) είναι συμμεταφορείς H+ ή Na+ ειδικοί για την πρόσληψη είτε πουρινών και πυριμιδινών είτε L-ασκορβικού οξέος [1]. Παρά το γεγονός ότι αρκετά μέλη έχουν μελετηθεί εκτενώς σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο και οι δομές μελών από το βακτήριο Escherichia coli and τον μύκητα Aspergillus nidulans έχουν δημοσιευθεί παρέχοντας μια πληθώρα δεδομένων για τον μηχανισμό λειτουργίας, τα υπάρχοντα δεδομένα δεν είναι ικανά να εξηγήσουν πλήρως το πως καθορίζεται η εκλεκτικότητα των υποστρωμάτων [2,3]. Καλά χαρακτηρισμένα μέλη από τα βακτήρια, τους μύκητες και τα φυτά μεταφέρουν ειδικά πουρίνες η/και πυριμιδίνες ενώ τα θηλαστικά και άλλα σπονδυλωτά διαθέτουν μέλη που είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ (SVCT1/2) αλλά και μέλη ειδικά για νουκλεοτιδικές βάσεις (π.χ. rSNBT1) [4,5]. Τα σπονδυλωτά διαθέτουν ένα επιπλέον παράλογο άγνωστης λειτουργιας (SVCT3) [5].Οι δομές από δυο μέλη της NAT οικογένειας είναι γνωστές [2,3,6]. Αυτές είναι η δομή του μεταφορέα ουρακίλης της E.coli UraA και του μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του A. nidulans UapA. Και οι δυο πρωτεΐνες αποτελούνται από 14 διαμεμβρανικά τμήματα που χαρακτηρίζονται από δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις (7+7) που αντιστοιχούν σε δύο επικράτειες, την επικράτεια πυρήνα (core domain) και την επικράτεια διμερισμού (dimerization domain). Και οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν διμερή, ο σχηματισμός των οποίων είναι απαραίτητος για την λειτουργία των μεταφορέων. Ο UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης/H+ του μύκητα A. nidulans και θεωρείται το πρότυπο, ευκαρυωτικό μέλος αυτής της οικογένειας επειδή είναι ένας από τους πιο εκτενώς χαρακτηρισμένους ευκαρυωτικούς μεταφορείς σε ότι αφορά τις σχέσεις-δομής λειτουργίας, την εκλεκτικότητα υποστρώματος, την ρύθμιση της έκφρασης και την υποκυτταρική διακίνηση [7]. Όλοι οι ΝΑΤ μεταφορείς περιέχουν ένα συντηρημένο μοτίβο στο 10ο διαμεμβρανικό τμήμα που ονομάστηκε ιστορικά σαν αλληλουχία-αναγνώρισης ΝΑΤ (NAT signature motif) το οποίο περιλαμβάνει κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για την δέσμευση υποστρώματος και την εκλεκτικότητα ή για την κατάλυση της μεταφοράς [1,8]. Προηγούμενες μελέτες στον UapA έδειξαν ότι οι περισσότερες μεταλλαγές που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα του, που έχουν προκύψει από τυχαίες μεταλλαξιγενέσεις, βρίσκονται εκτός της θέσης δέσμευσης υποστρώματος και της αλληλουχίας-μοτίβου ΝΑΤ [9–11]. Από αυτές οι πιο γνωστές μεταλλαγές αφορούν τα κατάλοιπα Arg481, Thr526 και Phe528 που εντοπίζονται κατά μήκος της πορείας κύλισης της επικράτειας πυρήνα πάνω στο διμερές. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι συγκεκριμένες αληλλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια στην επιφάνεια διμερισμού είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό ή/και την σταθερότητα των λειτουργικών διμερών [12]. Πιο συγκεκριμένα, κατά την διαδικασία απομόνωσης του UapA συγκατακρημνίζονται και λιπίδια και η απομάκρυνση αυτών των λιπιδίων οδηγεί σε διάλυση του διμερούς συμπλόκου σε μονομερή. Προσθήκη φωσφο-ινοσιτιδίων (PIs) ή φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (PEs) οδήγησε στον επανασχηματισμό του διμερούς. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MDs) προέβλεψαν την ύπαρξη μιας ειδικής θέσης δέσμευσης λιπιδίων στην επιφάνεια διμερισμού που αποτελείται από τρία κατάλοιπα αργινίνης Arg287, Arg478 και Arg479. Η αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων οδήγησε σε πλήρη απώλεια λειτουργίας η οποία οφείλεται στην απώλεια σχηματισμού του λειτουργικού διμερούς σε μεγάλο ποσοστό της πρωτεΐνης όπως αποδείχτηκε από φασματομετρία μάζας (native MS) και δοκιμασίες εντοπισμού πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα BiFC. H παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο ερευνήθηκε η μοριακή βάση της εξειδίκευσης υποστρώματος στην ΝΑΤ οικογένεια και μελετήθηκε η εξέλιξη των μεταφορέων ασκορβικού πραγματοποιώντας αρχικά μια εκτενή φυλογενετική ανάλυση και στη συνέχεια μεταλλαγές στο μοτίβο ΝΑΤ του UapA. Την παραπάνω συστηματική μεταλλαξιγένεση ακολούθησε ορθολογικά σχεδιασμένος συνδυασμός υποκαταστάσεων ενώ απομονώθηκαν νέες επιπλέον υποκαταστάσεις μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων. Τα αποτελέσματα συνολικά υποστηρίζουν ότι ο ρόλος κάποιων μερικώς συντηρημένων καταλοίπων του μοτίβου NAT στην εξειδίκευση του μεταφορέα UapA εξαρτάται από την ύπαρξη συγκεκριμένων αμινοξέων σε άλλες θέσεις. Επιπλέον παρουσιάζονται νέα δεδομένα για το πώς το κατάλοιπο Phe528, που βρίσκεται εκτός της θέσης πρόσδεσης υποστρώματος, μπορεί να επηρεάζει την εκλεκτικότητα του UapA. Tο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής αφορά τον ρόλο των αλληλεπιδράσεων του UapA με λιπίδια στη λειτουργία, τη σταθερότητα και τη μεταφορά του στη μεμβράνη. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε περαιτέρω ο ρόλος των αλληλεπιδράσεων στην επιφάνεια διμερισμού και διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος άλλων αλληλεπιδράσεων, που έχουν προβλεφθεί από MDs, στην περιφέρεια της επικράτειας πυρήνα του UapA. Βρέθηκε πως διακριτές αλληλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια είναι απαραίτητες για τον εξαρχής σχηματισμό διμερών στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ή την έξοδο από αυτό και την περαιτέρω στόχευση του στη μεμβράνη. Επιπλέον, μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων απομονώθηκαν μεταλλαγές που επαναφέρουν τον σχηματισμό διμερών ή/και τη στόχευση στη μεμβράνη. Τέλος, στο τρίτο μέρος, χρησιμοποιώντας αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έγινε για πρώτη φορά λειτουργική ετερόλογη έκφραση μιας NAT ομόλογης πρωτεΐνης από τα θηλαστικά στον A. nidulans.

Structural Interplays in the Flexible N-Terminus and Scaffolding Domain of Human Membrane Protein Caveolin 3

Caveolins are critical for the formation of caveolae, which are small invaginations of the plasma membrane involved in a variety of biological processes. Caveolin 3 (Cav3), one of three caveolin isoforms, is an integral membrane protein mainly expressed in muscle tissues. Although various human diseases associated with Cav3 have been reported, structural characterization of Cav3 in the membrane has not been investigated in enough depth to understand the structure–function relationship. Here, using solution NMR, we characterized membrane association, structural communications, and molecular dynamics of the monomeric Cav3 in detergent micelle environment, particularly focused on the whole N-terminal part that is composed of the flexible N-terminus and the scaffolding domain. The results revealed a complicated structural interplay of the individual segments composing the whole N-terminal part, including the pH-dependent helical region, signature motif-like region, signature motif, and scaffolding domain. Collectively, the present study provides novel structural insights into the whole N-terminal part of Cav3 that plays important biological roles in cellular processes and diseases. In particular, given that several disease-related mutations are located at the whole N-terminal part of Cav3, the sophisticated communications in the whole N-terminal segments are likely to have relevance to the molecular basis of Cav3-related disease.

Expression of Photosynthesis Pathway Gene From Rice and Maize for Understanding Role in Plant Stress and Development Using Bioinformatics Approaches

Background Rice and maize go to family Poaceae contains many crops of agronomic trait and also represent two carbon metabolism systems, C3 and C4. Analysis of the maize sequence provides new insights into the employment of C3 genes to the C4 mechanism which allowed us to identify more orthologs in other crops. This investigation reports comparative account of genome wide in silico identification of C4 pathway related genes from Zea maize (Zm) and Oryza sativa (Os) from the available whole genome sequence information. The annotation of gene sequences, signature motif analysis, protein phophorylation analysis, study of upstream cis-acting elements, phylogenetic tree construction, chromosomal locations, syntenic mapping and microarray expression analysis of C4 pathway related gene family from both the genomes have been attempted. Results A total of 30 and 37 C4-pathway genes have been predicted from rice and maize genome respectively. Multiple-sequence-alignment and signature motif analysis of these proteins of rice and maize revealed high conserveness. Phophorylation analysis revealed that maize have high number than rice. The phylogenetic analysis of C4 related genes across both plant species clearly resulted in four sub-groups in both plants. In Rice, the 30 genes of C4 pathway related genes family are distributed on eleven out of twelve chromosomes, while in maize, they are randomly distributed on all the chromosomes. Most of the genes of Zm’s chromosome 1 show syntenic relationship with chromosome 1. The cis-regulatory-elements of Zm and Os genes suggested its diverse functions associated with plant growth development, stress and hormone responsiveness as well as endosperm and meristem specific gene expression. This investigation of Zm and Os can now offer new insights into the role of different C4 pathway related genes and examine the comparative syntenic mapping between two monocot models and allows for better understanding about how genes evolve within monocots. Therefore, in silico investigation of C4-photosynthetic-pathway gene family needs to be supported by wet lab experimentation of the novel genes for elucidating their function in many biological courses.Conclusion Results revealed that photosynthetic pathway related gene play a potent role in stress response and plant growth and development.

Predatory War, Drones and Torture: Remapping the Body in Pain

Elaine Scarry argues in The Body in Pain that war is a vast and reciprocal swearing on the body, with corporeality key not only to its brutal prosecution but also to the eventual ending of the political ‘crisis of substantiation’ that war entails. However, her work has not been extensively explored with reference to significant transformations in the embodied experiences of contemporary warfare. This article thus analyses a particular articulation of late modern warfare that I term predatory war, whose current signature motif is the drone strike, through the lens of Scarry’s work. Here, the associated modes of embodiment are radically non-reciprocal, the woundscapes of conflict are profoundly asymmetric, and the affective mediation of bodily injury does not substantiate any ending to the conflict. As such, I argue that the ontology and phenomenology of predatory war increasingly resembles what Scarry identifies as the underlying structure of torture.