Structure-function relationships in transmembrane transporters

Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που πραγματοποιούν την επιλεκτική μεταφορά ουσιών μέσω των μεμβρανών. Τα μέλη της οικογένειας μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter family) είναι συμμεταφορείς H+ ή Na+ ειδικοί για την πρόσληψη είτε πουρινών και πυριμιδινών είτε L-ασκορβικού οξέος [1]. Παρά το γεγονός ότι αρκετά μέλη έχουν μελετηθεί εκτενώς σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο και οι δομές μελών από το βακτήριο Escherichia coli and τον μύκητα Aspergillus nidulans έχουν δημοσιευθεί παρέχοντας μια πληθώρα δεδομένων για τον μηχανισμό λειτουργίας, τα υπάρχοντα δεδομένα δεν είναι ικανά να εξηγήσουν πλήρως το πως καθορίζεται η εκλεκτικότητα των υποστρωμάτων [2,3]. Καλά χαρακτηρισμένα μέλη από τα βακτήρια, τους μύκητες και τα φυτά μεταφέρουν ειδικά πουρίνες η/και πυριμιδίνες ενώ τα θηλαστικά και άλλα σπονδυλωτά διαθέτουν μέλη που είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ (SVCT1/2) αλλά και μέλη ειδικά για νουκλεοτιδικές βάσεις (π.χ. rSNBT1) [4,5]. Τα σπονδυλωτά διαθέτουν ένα επιπλέον παράλογο άγνωστης λειτουργιας (SVCT3) [5].Οι δομές από δυο μέλη της NAT οικογένειας είναι γνωστές [2,3,6]. Αυτές είναι η δομή του μεταφορέα ουρακίλης της E.coli UraA και του μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του A. nidulans UapA. Και οι δυο πρωτεΐνες αποτελούνται από 14 διαμεμβρανικά τμήματα που χαρακτηρίζονται από δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις (7+7) που αντιστοιχούν σε δύο επικράτειες, την επικράτεια πυρήνα (core domain) και την επικράτεια διμερισμού (dimerization domain). Και οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν διμερή, ο σχηματισμός των οποίων είναι απαραίτητος για την λειτουργία των μεταφορέων. Ο UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης/H+ του μύκητα A. nidulans και θεωρείται το πρότυπο, ευκαρυωτικό μέλος αυτής της οικογένειας επειδή είναι ένας από τους πιο εκτενώς χαρακτηρισμένους ευκαρυωτικούς μεταφορείς σε ότι αφορά τις σχέσεις-δομής λειτουργίας, την εκλεκτικότητα υποστρώματος, την ρύθμιση της έκφρασης και την υποκυτταρική διακίνηση [7]. Όλοι οι ΝΑΤ μεταφορείς περιέχουν ένα συντηρημένο μοτίβο στο 10ο διαμεμβρανικό τμήμα που ονομάστηκε ιστορικά σαν αλληλουχία-αναγνώρισης ΝΑΤ (NAT signature motif) το οποίο περιλαμβάνει κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για την δέσμευση υποστρώματος και την εκλεκτικότητα ή για την κατάλυση της μεταφοράς [1,8]. Προηγούμενες μελέτες στον UapA έδειξαν ότι οι περισσότερες μεταλλαγές που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα του, που έχουν προκύψει από τυχαίες μεταλλαξιγενέσεις, βρίσκονται εκτός της θέσης δέσμευσης υποστρώματος και της αλληλουχίας-μοτίβου ΝΑΤ [9–11]. Από αυτές οι πιο γνωστές μεταλλαγές αφορούν τα κατάλοιπα Arg481, Thr526 και Phe528 που εντοπίζονται κατά μήκος της πορείας κύλισης της επικράτειας πυρήνα πάνω στο διμερές. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι συγκεκριμένες αληλλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια στην επιφάνεια διμερισμού είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό ή/και την σταθερότητα των λειτουργικών διμερών [12]. Πιο συγκεκριμένα, κατά την διαδικασία απομόνωσης του UapA συγκατακρημνίζονται και λιπίδια και η απομάκρυνση αυτών των λιπιδίων οδηγεί σε διάλυση του διμερούς συμπλόκου σε μονομερή. Προσθήκη φωσφο-ινοσιτιδίων (PIs) ή φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (PEs) οδήγησε στον επανασχηματισμό του διμερούς. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MDs) προέβλεψαν την ύπαρξη μιας ειδικής θέσης δέσμευσης λιπιδίων στην επιφάνεια διμερισμού που αποτελείται από τρία κατάλοιπα αργινίνης Arg287, Arg478 και Arg479. Η αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων οδήγησε σε πλήρη απώλεια λειτουργίας η οποία οφείλεται στην απώλεια σχηματισμού του λειτουργικού διμερούς σε μεγάλο ποσοστό της πρωτεΐνης όπως αποδείχτηκε από φασματομετρία μάζας (native MS) και δοκιμασίες εντοπισμού πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα BiFC. H παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο ερευνήθηκε η μοριακή βάση της εξειδίκευσης υποστρώματος στην ΝΑΤ οικογένεια και μελετήθηκε η εξέλιξη των μεταφορέων ασκορβικού πραγματοποιώντας αρχικά μια εκτενή φυλογενετική ανάλυση και στη συνέχεια μεταλλαγές στο μοτίβο ΝΑΤ του UapA. Την παραπάνω συστηματική μεταλλαξιγένεση ακολούθησε ορθολογικά σχεδιασμένος συνδυασμός υποκαταστάσεων ενώ απομονώθηκαν νέες επιπλέον υποκαταστάσεις μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων. Τα αποτελέσματα συνολικά υποστηρίζουν ότι ο ρόλος κάποιων μερικώς συντηρημένων καταλοίπων του μοτίβου NAT στην εξειδίκευση του μεταφορέα UapA εξαρτάται από την ύπαρξη συγκεκριμένων αμινοξέων σε άλλες θέσεις. Επιπλέον παρουσιάζονται νέα δεδομένα για το πώς το κατάλοιπο Phe528, που βρίσκεται εκτός της θέσης πρόσδεσης υποστρώματος, μπορεί να επηρεάζει την εκλεκτικότητα του UapA. Tο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής αφορά τον ρόλο των αλληλεπιδράσεων του UapA με λιπίδια στη λειτουργία, τη σταθερότητα και τη μεταφορά του στη μεμβράνη. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε περαιτέρω ο ρόλος των αλληλεπιδράσεων στην επιφάνεια διμερισμού και διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος άλλων αλληλεπιδράσεων, που έχουν προβλεφθεί από MDs, στην περιφέρεια της επικράτειας πυρήνα του UapA. Βρέθηκε πως διακριτές αλληλεπιδράσεις του UapA με μεμβρανικά λιπίδια είναι απαραίτητες για τον εξαρχής σχηματισμό διμερών στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ή την έξοδο από αυτό και την περαιτέρω στόχευση του στη μεμβράνη. Επιπλέον, μέσω τυχαίων μεταλλαξιγενέσεων απομονώθηκαν μεταλλαγές που επαναφέρουν τον σχηματισμό διμερών ή/και τη στόχευση στη μεμβράνη. Τέλος, στο τρίτο μέρος, χρησιμοποιώντας αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έγινε για πρώτη φορά λειτουργική ετερόλογη έκφραση μιας NAT ομόλογης πρωτεΐνης από τα θηλαστικά στον A. nidulans.