Adição de antioxidantes ao sêmen de carneiros e seus efeitos após a descongelação

RESUMO: Objetivou-se avaliar o efeito da adição dos antioxidantes ácido ascórbico, melatonina e Trolox C, associados ao sêmen diluído de carneiros sobre o estresse oxidativo e o potencial fecundante após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de 3 carneiros (n=30) e diluídos em Tris-Gema de ovo até a concentração final de 200x106 sptz/mL e, mantidos em banho maria a 32°C. Os antioxidantes foram adicionados da seguinte forma: controle (sem adição de antioxidantes); 100μM de melatonina (MEL) + 0,05% de ácido ascórbico (AA); 100μM de MEL + 90μL de Trolox C (TRO); 90μL de TRO + 0,05% de AA; e 100μM de MEL + 0,05%AA + 90μL de TRO. Depois, o sêmen foi resfriado em câmara fria a 5°C por duas horas, após esse período, envasado e lacrado em palhetas de 0,5mL, e então acondicionado sob vapor de nitrogênio liquido (N2L), a 8cm da lâmina líquida por 15 minutos, e depois imersos no N2L. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial, teste de ligação e a quantificação do estresse oxidativo. As variáveis foram submetidas à análise de variância e medias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade (total e progressiva) foi maior (P<0,05) quando adicionado à associação MEL+AA+TRO (67% e 49,89%), MEL+AA (64,37% e 45,61%) e MEL+TRO (61,65% e 41,15%) comparado ao tratamento controle (55,52% e 36,54%) e TRO+AA (57,07% e 38,40%). A adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído manteve (P<0,05) a integridade da membrana plasmática (30,75%) e acrossomal (84,53%) dos espermatozoides quando comparado ao tratamento controle (15,60 e 68,16%, respectivamente), além de ter promovido maior (P<0,05) atividade mitocondrial (96,43%) quando comparado aos demais tratamentos. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com as diferentes associações de antioxidante quando comparado ao controle, sendo a associação MEL+AA+TRO (178,36%) superior (P<0,05) aos demais tratamentos. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto a quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico produzidos. Conclui-se que a adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído de carneiros, nas doses avaliadas, melhora a qualidade espermática após descongelação.

49 EFFECT OF ADDING Trolox C AND ASCORBIC ACID TO RAM SPERM BEFORE CRYOPRESERVATION ON THE MOTILITY AND BINDING CAPABILITY

Different antioxidants have been tested to improve sperm quality, but distinct and consistent beneficial effects are lacking. The objective of this study was to evaluate whether the addition of different concentrations of the antioxidant Trolox C and ascorbic acid before cryopreservation could improve the binding of sperm to chicken egg perivitelline membrane (PM) after cryopreservation. Three ejaculates of ram were split and diluted with Tris egg yolk diluent to a final concentration of 200 × 106 cells mL–1, and after, the ejaculates were divided into 5 tubes. Each tube received one of the following antioxidants: control, no antioxidant; 200 μM of Trolox C; 300 μM of Trolox C; 0.05% of ascorbic acid; and 0.25% of ascorbic acid. The samples were cooled to 5°C/2 h, packaged into 0.5-mL straws, and frozen in static LN vapor for 15 min before being plunged into LN. Straws were thawed (37°C/30 s). The motility was determined using computer-assisted semen analysis. For PM binding test, PM was put in tubes with 1 mL of TALP and inseminated with 50 000 sperm. The PM and sperm were incubated for 90 min at 37°C in an atmosphere of 5% CO2 in air, and 20 min before the end of the incubation time, 10 μL of Hoechst 33342 was added in each treatment. After each PM was washed 5 times in TALP, placed under the coverslip on a slide, and evaluated by fluorescence microscopy at 400×. Spermatozoa were counted in 6 random fields of each piece of PM. Percentage data were transformed using arcsine prior analysis. Treatment differences were determine by analysis of variance and Tukey test. The total and progressive motility of sperm treated with 0.25% ascorbic acid Trolox C was higher (64.5 and 45%) than 100 μM of Trolox C (61.9 and 42.6%) and 200 μM of Trolox C (64.3 and 46.7%) and control (59.8 and 39.6%; P < 0.05), respectively. The binding test was higher when using 0.25% of ascorbic acid (155.73 cells; P < 0.05) compared with other treatments. Addition of 0.25% ascorbic acid to ram sperm before cryopreservation improved cell cryosurvival rates.