scholarly journals In vitro μελέτη της πρωτεΐνης Enhancer of RNA interference 1 της Arabidopsis thaliana

2017 ◽  
Author(s):  
Ιωάννης Βλατάκης
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Rna Interference ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
5S Rrna

Οι ERI1 εξωνουκλεάσες αποτελούν μία σημαντική ομάδα ρυθμιστικών 3’ εξωνουκλεασών με συμμετοχή στην ωρίμανση του 3’ άκρου κωδικών και μη κωδικών μεταγράφων ενώ στους ευκαρυώτες φαίνεται εξελικτικά να εμπλέκεται στην ρύθμιση των μονοπατιών των siRNAs. Η μελέτη των φυτικών ομολόγων σε φυτά Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana έδειξαν εμπλοκή των φυτικών εκπροσώπων της υποομάδας των ERI1 στη ρύθμιση της ωρίμανσης χλωροπλαστιδιακών rRNA. Προκειμένου να αποκτηθούν επιπλέον πληροφορίες σε σχέση με την δράση της έγινε με την παρούσα εργασία μια βιοχημική μελέτη της ομολόγου πρωτεΐνης από την Α.thaliana, AtERIL1. H AtERIL1 διατηρεί την ενεργότητα της 3’ εξωνουκλεάσης με προτίμηση σε μονόκλωνα μικρά RNA. Με μικρότερη προτίμηση υδρολύει μικρά DNA υποστρώματα και μονόκλωνα RNA με κυτοσίνη στο 3’ άκρο τους. Παρά την απουσία κάποιας συντηρημένης περιοχής πρόσδεση σε νουκλεϊκά οξέα, η AtERIL1 διατηρεί την ικανότητα πρόσδεσης σε πρόδρομα 5S rRNA μόρια και μικρά μονόκλωνα και δίκλωνα RNA και DNA ολιγονουκλεοτίδια. Στην ικανότητα πρόσδεσης σημαντικό ρόλο έχουν δύο κατάλοιπα λυσίνης που βρίσκονται πριν από την επικράτεια εξωνουκλεάσης. Η απουσία ανάκτησης υδρολυτικής δράσης σε πρόδρομα rRNA μόρια κατά την εκπόνηση in vitro πειραμάτων αφήνει το ενδεχόμενο έμμεσης επίδρασης στην ωρίμανση των χλωροπλαστιδιακών rRNAs ή την άμεση δράση σε σύμπλοκο με κάποιον άλλο πρωτεϊνικό ή μη παράγοντα. Επιπλέον η ικανότητα της AtERIL1` να συμπληρώνει λειτουργικά βακτηριακές 3’ εξωνουκλεάσες δοκιμάστηκε με αρνητικά αποτελέσματα. Τέλος, η επέκταση του βιολογικού ρόλου της AtERIL1 στην ρύθμιση και άλλων τύπων RNA πέραν τον ριβοσωμικών του χλωροπλάστη επιβεβαιώθηκε με υβριδοποίηση κατά northern, oπερονίων tRNA μεταγράφων που βρέθηκαν να ανοσοκατακρημνίζονται με την AtERIL1, σε σειρές υπερέκφρασης και καταστολής της AtERIL1. Οι παρατηρήσεις που πραγματοποιήθηκαν κατά την διδακτορική διατριβή επιβεβαιώνουν ιδιότητες των ERI1 πρωτεϊνών στις φυτικές ομολόγους ενώ θέτουν πιο στέρεες βάσεις για υποθέσεις γύρω από το μηχανισμό και το εύρος των πιθανών φυσικών τους υποστρωμάτων στους χλωροπλάστες.

scholarly journals In vitro analysis of the sequences required for transcription of the Arabidopsis thaliana 5S rRNA genes

2003 ◽  
Vol 35 (2) ◽  
pp. 251-261 ◽  
Author(s):  
Catherine Cloix ◽  
Yasushi Yukawa ◽  
Sylvie Tutois ◽  
Masahiro Sugiura ◽  
Sylvette Tourmente
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
5S Rrna ◽  
Rrna Genes ◽  
5S Rrna Genes ◽  
Vitro Analysis ◽  
In Vitro Analysis

scholarly journals Enhanced RNA interference - 1 - like - 1

2015 ◽  
Author(s):  
Γλυκερία Μέρμηγκα
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Green Fluorescent Protein ◽  
Rna Interference ◽  
Schizosaccharomyces Pombe ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Green Fluorescent

Οι ριβονουκλεάσες αποτελούν μια ομάδα ενζύμων που συμμετέχουν σε μια πληθώρα διαδικασιών σε όλους τους οργανισμούς από τους ιούς έως τους ανώτερους ευκαρυώτες. Η λήξη της μεταγραφής, η ωρίμανση και επιδιόρθωση των μεταγράφων αλλά και ο μηχανισμός της RNA σίγησης αποτελούν μερικά από τα μονοπάτια στα οποία προεξέχοντα ρόλο επιτελεί αυτή η ομάδα ενζύμων. Ανάλογα με τη θέση δράσης τους πάνω στο υπόστρωμα αλλά και κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους κατηγοριοποιούνται σε διάφορες οικογένειες μεταξύ των οποίων είναι και η υποοικογένεια Enhancer of RNA interference-1 (ERI-1). Οι πρωτεΐνες τη ομάδας αυτής είναι 3’-5’ εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των DEDDh νουκλεασών, στην οποία μεταξύ άλλων ανήκουν και οι βακτηριακές ολιγοριβονουκλεάση και RNase T. Οι Eri-1 πρωτεΐνες είναι συντηρημένες στους ευκαρυώτες στους οποίους δρα ο μηχανισμός της RNA σίγησης, από το νηματώδη σκώληκα έως το ποντίκι, τον άνθρωπο, τη δροσόφιλα, τον Schizosaccharomyces pombe αλλά και τα φυτά. Συμμετέχουν σε διάφορες διαδικασίες όπως είναι η αποικοδόμηση των μικρών παρεμβαλλόμενων RNA (siRNA), δρώντας κατά αυτόν τον τρόπο στο μονοπάτι της RNA σίγησης, η ωρίμανση και αποικοδόμηση των ιστονικών μεταγράφων αλλά και η ωρίμανση του 5.8S ριβοσωμικού RNA. Το Eri-1 ομόλογο (ERI-1-Like-1, ERIL1) του φυτού Arabidopsis thaliana έχει χλωροπλαστιδιακή στόχευση ενώ φυτά Nicotiana benthamiana που υπερεκφράζουν το διαγονίδιο παρουσιάζουν χλωρωτικούς φαινοτύπους, με χλωροπλάστες που μοιάζουν προπλαστίδια . Από μοριακή ανάλυση των διαγονιδιακών αυτών σειρών προέκυψε ότι τα χλωροπλαστιδιακά μετάγραφα παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη της δράσης του Eri-1 ομολόγου στα φυτά (ERI-1-Like-1, ERIL) και συγκεκριμένα στα φυτά-μοντέλα Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana. Αρχικά, και λόγω της παρουσίας δύο παραλόγων γονιδίων στο είδος N. benthamiana, κλωνοποιήθηκαν τα μετάγραφα όπου και διαπιστώθηκε ότι από το ένα παράλογο γονίδιο προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δύο ισομορφές. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του εναλλακτικού ματίσματος στον ενδοκυττάριο εντοπισμό της παραγόμενης πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης της συγκεκριμένης γονιδιακής θέσης συντηγμένης με την πρωτεΐνη αναφοράς Green Fluorescent Protein, όπου με συνεστιακή μικροσκοπία διαπιστώθηκε ο χλωροπλαστιδιακός εντοπισμός. Η χλωροπλαστιδιακή στόχευση της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε και με ανάλυση τύπου western σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χλωροπλαστών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός των σειρών που παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης με αναλύσεις τύπου northern και western. Αυτές οι σειρές μαζί με σειρές υπερέκφρασης του διαγονιδίου οι οποίες είχαν χαρακτηριστεί από προηγούμενες μελέτες αποτέλεσαν τα εργαλεία για τη μελέτη της δράσης της υπό μελέτης πρωτεΐνης. Οι σειρές με έντονη καταστολή παρουσίαζαν μειωμένα επίπεδα χλωροφυλλών σε σχέση με φυτά αγρίου τύπου ενώ από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε τομές φύλλων φυτών N.benthamiana με καταστολή των ERIL1 γονιδίων διαπιστώθηκαν ότι οι χλωροπλάστες παρουσίαζαν παρεκκλίνουσα ανατομία. Από μοριακή ανάλυση τύπου northern φυτών με καταστολή και υπερέκφραση του ERIL1 διαπιστώθηκαν παρεκκλίνοντα πρότυπα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών μεταγράφων του χλωροπλάστη υποδεικνύοντας τη συμμετοχή της πρωτεΐνης στην ωρίμανση αυτών των μεταγράφων. Επιπλέον, με ανοσοκατακρήμνιση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη συγκατακρημνίζεται εκτός των ριβοσωμικών μεταγράφων και με ορισμένα άλλα χλωροπλαστιδιακά νουκλεϊκά οξέα υποδεικνύοντας κάποιο πιθανό ρόλο στην ωρίμανση αυτών. Τέλος, με παροδική υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε αναπτυγμένα φύλλα N. benthamiana παρατηρήθηκε επίδραση της στην αποικοδόμηση του ώριμου 4.5S rRNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της υπό μελέτης πρωτεΐνης στο μηχανισμό της RNA σίγησης. Από αυτά δεν διαπιστώθηκε κάποια επίδραση στο μονοπάτια που μελετήθηκαν, ενώ μόνο τα φυτά που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα συγκεκριμένων miRNA. Συνολικά, από τα πειράματα της παρούσας μελέτης συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη ERIL1 δρα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών χλωροπλαστιδιακών μεταγράφων και στην αποικοδόμηση του 4.5S rRNA ενώ δεν φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στα μονοπάτια της RNA σίγησης που μελετήθηκαν.

RNA interference and its clinical applications

2007 ◽  
Vol 148 (47) ◽  
pp. 2235-2240 ◽  
Author(s):  
Gyöngyi Munkácsy ◽  
Zsolt Tulassay ◽  
Balázs Győrffy
Keyword(s):  
Rna Interference ◽  
Clinical Applications

Az RNS-interferencia a poszttranszkripciós génelcsendesítés olyan formája, amelynek során rövid, specifikusan RNS-molekulák elnyomják a gének kifejeződésében kulcsszerepet játszó hírvivő RNS-ek működését. A sejtbe juttatott dupla szálú vagy rövid interferáló RNS-molekulák aktiválják az RNS-indukált elcsendesítő komplexet, amely a célgén hírvivő RNS-ét lebontja. A sejtek saját szabályozó mikro-RNS-molekulákkal is rendelkeznek, amelyeknek hírvivő RNS-e képes önmagával hajtűt képezni, amit a sejt dupla szálú RNS-ként értelmez. Az RNS-interferencia élettani működései közé tartozik a vírusok és a transzpozonok elleni védekezés, valamint a génkifejeződés szabályozása. Az RNS-interferencia nemcsak in vitro alkalmazható az egyes gének működésének vizsgálatára, hanem klinikai alkalmazásainak lehetőségei is megjelentek. Eddig vírusfertőzésekben, az időskori makuladegeneráció gátlására, a vér koleszterinszint-csökkentésére, daganatellenes és neurodegeneratív betegségek kezelésében alkalmazták. Az RNS-interferencia alkalmazását azonban nehezíti, hogy a megfelelő rövid interferáló RNS-molekulák tervezéséhez szükséges bioinformatikai algoritmusok nem tökéletesek; a szervezet szöveteibe való bejuttatásuk nehéz; illetve csak olyan esetekben alkalmazható, amelyekben átmeneti antagonista génelcsendesítő hatás és nem hosszú távú kezelés szükséges. Az alkalmazás legnagyobb előnye a jelentős specificitás, ami miatt mellékhatása is kevés. Az RNS-interferencia alapú kezelések megjelenése már a közeli jövőben várható.

scholarly journals The Arabidopsis thaliana chloroplast division protein FtsZ1 counterbalances FtsZ2 filament stability in vitro

2021 ◽  
pp. 100627
Author(s):  
Katie J. Porter ◽  
Lingyan Cao ◽  
Yaodong Chen ◽  
Allan D. TerBush ◽  
Cheng Chen ◽  
...  
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Chloroplast Division

scholarly journals Suppression of parathyroid hormone production in vitro and in vivo by RNA interference

2009 ◽  
Vol 75 (5) ◽  
pp. 490-498 ◽  
Author(s):  
Genta Kanai ◽  
Takatoshi Kakuta ◽  
Kaichiro Sawada ◽  
Tun A. Yokoyama ◽  
Reika Tanaka ◽  
...  
Keyword(s):  
Parathyroid Hormone ◽  
Rna Interference ◽  
Hormone Production
Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document