scholarly journals Engineering and optimization of the 2‐phenylethylglucosinolate production in Nicotiana benthamiana by combining biosynthetic genes from Barbarea vulgaris and Arabidopsis thaliana

2021 ◽  
Author(s):  
Cuiwei Wang ◽  
Christoph Crocoll ◽  
Niels Agerbirk ◽  
Barbara Ann Halkier
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Barbarea Vulgaris ◽  
Biosynthetic Genes

scholarly journals Genome organization, functional analysis of biosynthetic genes and metabolic diversity of triterpenes in legumes

2013 ◽  
Author(s):  
Αφροδίτη Κροκιδά
Keyword(s):  
Functional Analysis ◽  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Genome Organization ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Lotus Japonicus ◽  
Metabolic Diversity ◽  
Biosynthetic Genes ◽  
Mesorhizobium Loti

Τα τριτερπένια είναι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες που προέρχονται από την κυκλοποίηση του 2,3-οξειδοσκουαλενίου από εξειδικευμένα ένζυμα, τις συνθάσες ή κυκλάσες του οξειδοσκουαλενίου. Ο ρόλος της συνθάσης της λουπεόλης, που κωδικοποιείται από το γονίδιο OSC3, καθώς και το προϊόν του, λουπεόλη, διερευνήθηκε σε αναπτυσσόμενες ρίζες και φυμάτια του μοντέλου-ψυχανθούς Lotus japonicus. Τα πρότυπα έκφρασης του γονιδίου OSC3 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια μη μολυσμένων και μολυσμένων ριζών με το συμβιώτη Mesorhizobium loti καθορίστηκαν. Η ιστοειδική έκφραση του γονιδίου OSC3 καθορίστηκε με in situ υβριδισμό. Πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση σε μετασχηματισμένες ρίζες που παρουσίαζαν αποσιώπηση του γονιδίου OSC3. Στις μετασχηματισμένες ρίζες καθορίστηκε η απουσία παραγωγής λουπεόλης με GC-MS. Τα μετασχηματισμένα φυτά παρουσίασαν το φαινότυπο της πιο ταχείας φυματιογένεσης σε σύγκριση με τα φυτά – μάρτυρες. Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου ENOD40, γονίδιο δείκτης της έναρξης σχηματισμού των καταβολών των φυματίων, αυξήθηκε σημαντικά στα μετασχηματισμένα φυτά. Η εξωγενής παροχή λουπεόλης σε αγρίου τύπου φυτά παρείχε επιπλέον ενδείξεις για τον αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο της λουπεόλης στην έκφραση του γονιδίου ENOD40. Η βιοσύνθεση της λουπεόλης μπορεί να αποδωθεί αποκλειστικά στο γονίδιο OSC3. Λαμβάνοντας όλα αυτά υπ’όψιν, προτείνεται στη λουπεόλη ένας ρόλος στο σχηματισμό των φυματίων μέσω της ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου ENOD40. Επιπρόσθετα, τα γονίδια που συμμετέχουν σε μονοπάτια βιοσύνθεσης τριτερπενοειδών οργανώνονται σε γονιδιακές συστοιχίες στα φυτά της βρώμης και του Arabidopsis thaliana. Η παρουσία μιας ανάλογης γονιδιακής συστοιχίας στο φυτό L. japonicus ταυτοποιήθηκε. Στη γονιδιωματική περιοχή που εδράζεται το γονίδιο της συνθάσης της β-αμυρίνης, εντοπίστηκαν δύο γονίδια του κυτοχρώματος Ρ450 καθώς και μία ρεδουκτάση. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της γονιδιακής συστοιχίας πραγματοποιήθηκε με ετερόλογη έκφραση σε φύλλα Nicotiana benthamiana. Μια καινούρια δομή τριτερπενοειδούς, η διυδρολουπεόλη, παράγεται από την συνθάση της β-αμυρίνης. Επιπλέον, ένα καινούριο ένζυμο του κυτοχρώματος Ρ450, το CYP71D353, χαρακτηρίστηκε, το οποίο καταλύει το σχηματισμό του 20-hydroxybetulinic acid μέσω τριών διαδοχικών βημάτων οξείδωσης της διυδρολουπεόλης. Τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων μελετήθηκαν σε διαφορετικές αναπτυξιακές και περιβαλλοντικές συνθήκες. Τα γονίδια της συστοιχίας συν-εκφράζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των φυματίων και των ριζών, σε φυτά που υποβληθήκαν σε καταπονήσεις και σε φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία ορμονών. Ο φυσιολογικός ρόλος της γονιδιακής συστοιχίας στη φυματιογένεση και στην φυτική ανάπτυξη μελετήθηκε σε μετασχηματισμένα φυτά με αποσιώπηση. Επιπλέον, αποκαλύφθηκε ένας μηχανισμός επιγενετικής τροποποίησης που πιθανά εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής συστοιχίας. Μια γονιδιακή συστοιχία που αποτελείται από λειτουργικά συσχετιζόμενα γονίδια εμπλέκεται στη βιοσύνθεση τριτερπενοειδών στα ψυχανθή και πιθανά εμπλέκεται στη φυτική ανάπτυξη.

scholarly journals Engineering and optimization of the 2-phenylethylglucosinolate production in Nicotiana benthamiana by combining biosynthetic genes from Barbarea vulgaris and Arabidopsis thaliana

2020 ◽  
Author(s):  
Cuiwei Wang ◽  
Christoph Crocoll ◽  
Niels Agerbirk ◽  
Barbara Ann Halkier
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Biosynthetic Pathway ◽  
Fold Increase ◽  
Chain Elongation ◽  
Heterologous Host ◽  
Barbarea Vulgaris ◽  
Donor Plant ◽  
Defense Compounds ◽  
Novel Approach

AbstractAmong the glucosinolate (GLS) defense compounds characteristic of the Brassicales order, several have been shown to promote human health. This includes 2-phenylethylglucosinolate (2PE) derived from homophenylalanine (HPhe). In this study, we used transient expression in Nicotiana benthamiana to validate and characterize previously predicted key genes in the 2PE biosynthetic pathway from Barbarea vulgaris and demonstrate the feasibility of engineering 2PE production. We used genes from B. vulgaris and Arabidopsis thaliana, in which the biosynthesis of GLSs is predominantly derived from HPhe and dihomomethionine, respectively. The resulting GLS profiles partially mirrored GLS profiles in the gene donor plant, but in both cases the profiles in N. benthamiana were wider than in the native plants. We found that BvBCAT4 is a more efficient entry enzyme for biosynthesis of both HPhe and dihomomethionine and that MAM1 enzymes determine the chain-elongated profile. Co-expression of the chain elongation pathway and CYP79F6 from B. vulgaris with the remaining aliphatic GLS core pathway genes from A. thaliana, demonstrated the feasibility of engineering production of 2PE in N. benthamiana. Noticeably, the HPhe-converting enzyme BvCYP79F6 in the core GLS pathway belongs to the CYP79F subfamily, a family believed to have substrate specificity towards chain-elongated methionine derivatives. Replacing the B. vulgaris chain elongation pathway with a chimeric pathway consisting of BvBCAT4, BvMAM1, AtIPMI and AtIPMDH1 resulted in an additional 2-fold increase in 2PE production, demonstrating that chimeric pathway with genes from different species can increase flux and boost production in an engineered pathway. Our study provides a novel approach to produce the important HPhe and 2PE in a heterologous host. Chimeric engineering of a complex biosynthetic pathway enabled detailed understanding of catalytic properties of individual enzymes - a prerequisite for understanding biochemical evolution - and with biotechnological and plant breeding potentials of new-to-nature gene combinations.

scholarly journals In vitro μελέτη της πρωτεΐνης Enhancer of RNA interference 1 της Arabidopsis thaliana

2017 ◽  
Author(s):  
Ιωάννης Βλατάκης
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Rna Interference ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
5S Rrna

Οι ERI1 εξωνουκλεάσες αποτελούν μία σημαντική ομάδα ρυθμιστικών 3’ εξωνουκλεασών με συμμετοχή στην ωρίμανση του 3’ άκρου κωδικών και μη κωδικών μεταγράφων ενώ στους ευκαρυώτες φαίνεται εξελικτικά να εμπλέκεται στην ρύθμιση των μονοπατιών των siRNAs. Η μελέτη των φυτικών ομολόγων σε φυτά Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana έδειξαν εμπλοκή των φυτικών εκπροσώπων της υποομάδας των ERI1 στη ρύθμιση της ωρίμανσης χλωροπλαστιδιακών rRNA. Προκειμένου να αποκτηθούν επιπλέον πληροφορίες σε σχέση με την δράση της έγινε με την παρούσα εργασία μια βιοχημική μελέτη της ομολόγου πρωτεΐνης από την Α.thaliana, AtERIL1. H AtERIL1 διατηρεί την ενεργότητα της 3’ εξωνουκλεάσης με προτίμηση σε μονόκλωνα μικρά RNA. Με μικρότερη προτίμηση υδρολύει μικρά DNA υποστρώματα και μονόκλωνα RNA με κυτοσίνη στο 3’ άκρο τους. Παρά την απουσία κάποιας συντηρημένης περιοχής πρόσδεση σε νουκλεϊκά οξέα, η AtERIL1 διατηρεί την ικανότητα πρόσδεσης σε πρόδρομα 5S rRNA μόρια και μικρά μονόκλωνα και δίκλωνα RNA και DNA ολιγονουκλεοτίδια. Στην ικανότητα πρόσδεσης σημαντικό ρόλο έχουν δύο κατάλοιπα λυσίνης που βρίσκονται πριν από την επικράτεια εξωνουκλεάσης. Η απουσία ανάκτησης υδρολυτικής δράσης σε πρόδρομα rRNA μόρια κατά την εκπόνηση in vitro πειραμάτων αφήνει το ενδεχόμενο έμμεσης επίδρασης στην ωρίμανση των χλωροπλαστιδιακών rRNAs ή την άμεση δράση σε σύμπλοκο με κάποιον άλλο πρωτεϊνικό ή μη παράγοντα. Επιπλέον η ικανότητα της AtERIL1` να συμπληρώνει λειτουργικά βακτηριακές 3’ εξωνουκλεάσες δοκιμάστηκε με αρνητικά αποτελέσματα. Τέλος, η επέκταση του βιολογικού ρόλου της AtERIL1 στην ρύθμιση και άλλων τύπων RNA πέραν τον ριβοσωμικών του χλωροπλάστη επιβεβαιώθηκε με υβριδοποίηση κατά northern, oπερονίων tRNA μεταγράφων που βρέθηκαν να ανοσοκατακρημνίζονται με την AtERIL1, σε σειρές υπερέκφρασης και καταστολής της AtERIL1. Οι παρατηρήσεις που πραγματοποιήθηκαν κατά την διδακτορική διατριβή επιβεβαιώνουν ιδιότητες των ERI1 πρωτεϊνών στις φυτικές ομολόγους ενώ θέτουν πιο στέρεες βάσεις για υποθέσεις γύρω από το μηχανισμό και το εύρος των πιθανών φυσικών τους υποστρωμάτων στους χλωροπλάστες.

scholarly journals Cloning and Expression Analysis of the BocMBF1c Gene Involved in Heat Tolerance in Chinese Kale

2019 ◽  
Vol 20 (22) ◽  
pp. 5637 ◽  
Author(s):  
Lifang Zou ◽  
Bingwei Yu ◽  
Xing-Liang Ma ◽  
Bihao Cao ◽  
Guoju Chen ◽  
...  
Keyword(s):  
Arabidopsis Thaliana ◽  
Heat Stress ◽  
Green Fluorescent Protein ◽  
Stress Response ◽  
Nicotiana Benthamiana ◽  
Thermal Tolerance ◽  
Fluorescent Protein ◽  
Leaf Tissue ◽  
Chinese Kale ◽  
Green Fluorescent

Chinese kale (Brassica oleracea var. chinensis Lei) is an important vegetable crop in South China, valued for its nutritional content and taste. Nonetheless, the thermal tolerance of Chinese kale still needs improvement. Molecular characterization of Chinese kale’s heat stress response could provide a timely solution for developing a thermally tolerant Chinese kale variety. Here, we report the cloning of multi-protein bridging factor (MBF) 1c from Chinese kale (BocMBF1c), an ortholog to the key heat stress responsive gene MBF1c. Phylogenetic analysis showed that BocMBF1c is highly similar to the stress-response transcriptional coactivator MBF1c from Arabidopsis thaliana (AtMBF1c), and the BocMBF1c coding region conserves MBF1 and helix-turn-helix (HTH) domains. Moreover, the promoter region of BocMBF1c contains three heat shock elements (HSEs) and, thus, is highly responsive to heat treatment. This was verified in Nicotiana benthamiana leaf tissue using a green fluorescent protein (GFP) reporter. In addition, the expression of BocMBF1c can be induced by various abiotic stresses in Chinese kale which indicates the involvement of stress responses. The BocMBF1c-eGFP (enhanced green fluorescent protein) chimeric protein quickly translocated into the nucleus under high temperature treatment in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Overexpression of BocMBF1c in Arabidopsis thaliana results in a larger size and enhanced thermal tolerance compared with the wild type. Our results provide valuable insight for the role of BocMBF1c during heat stress in Chinese kale.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document