scholarly journals In vivo and in vitro analyses of a Bombyx mori nucleopolyhedrovirus mutant lacking functional vfgf

Virology ◽  
2006 ◽  
Vol 355 (1) ◽  
pp. 62-70 ◽  
Author(s):  
Susumu Katsuma ◽  
Satoshi Horie ◽  
Takaaki Daimon ◽  
Masashi Iwanaga ◽  
Toru Shimada
Keyword(s):  
Bombyx Mori ◽  
Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus

scholarly journals Μοριακή ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων σε λεπιδόπτερα έντομα

2014 ◽  
Author(s):  
Σωτήρης Τσατσαρούνος
Keyword(s):  
Bombyx Mori

Η γονιδιακή έκφραση, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και διαφοροποίησης, ελέγχεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μεταφραστικό επίπεδο. Όσον αφορά τη μεταγραφική ενεργοποίηση, που αποτελεί κύριο θέμα της παρούσας διατριβής, εξαρτάται σε πολύ σημαντικό βαθμό από τις αλληλουχίες των υποκινητών (ή/και των ενισχυτών). Η μελέτη των πολύπλοκων μοριακών μηχανισμών, που εμπλέκονται στη διαφορική γονιδιακή έκφραση, προϋποθέτει τη χρήση κατάλληλων συστημάτων-μοντέλων και ως ένα τέτοιο έχει αναδειχθεί το σύστημα της χοριογένεσης (σχηματισμός κελύφους του αυγού) στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori. Συγκεκριμένα, κάθε ένα από τα οκτώ ωοθηκάρια του μεταξοσκώληκα περιλαμβάνει μια σειρά διαδοχικά αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων και έτσι κάθε ωοθυλάκιο αντιπροσωπεύει ένα αναπτυξιακό στάδιο. Παρόλο που η αναπτυξιακή διαφοροποίηση των ωοθυλακίων είναι συνεχής, είναι δυνατή μια συμβατική διαίρεση της όλης πορείας σε τρία στάδια (πρώιμα, ενδιάμεσα και όψιμα) με βάση το γενικό πρότυπο έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων του χορίου. Στην πλειοψηφία τους, τα γονίδια του χορίου είναι οργανωμένα σε ζεύγη (α και β τύπου) ίδιας αναπτυξιακής εξειδίκευσης, με αντιπαράλληλη κατεύθυνση μεταγραφής και κοινή 5' ρυθμιστική περιοχή (~250 ζεύγη βάσεων).Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της «αρχιτεκτονικής» των υποκινητών, δηλαδή πώς συνδράμουν στην αναπτυξιακή εξειδίκευση της έκφρασης των γονιδίων του χορίου οι συγκεκριμένες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (C/EBP, GATA, HMGA, CHD1), ο προσανατολισμός τους, ο αριθμός τους ακόμα και οι μεταξύ τους σχετικές αποστάσεις. Ως βασική μέθοδο προσέγγισης, επιλέξαμε την τεχνική της ηλεκτροδιάτρησης (electroporation) μέσω της οποίας καθίσταται εφικτή η επιτυχής εισαγωγή και έκφραση γονιδιακών κατασκευών στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων του μεταξοσκώληκα Bombyx mori. Οι κατασκευές αυτές είναι τμήματα ανασυνδυασμένου DNA που περιέχουν το γονίδιο αναφοράς lacZ, υπό τον έλεγχο άρτιων ή/και τροποποιημένων υποκινητών αντιπροσωπευτικών γονιδίων του χορίου. Η όλη προσέγγιση προσομοιάζει την in vivo κατάσταση. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των παραμέτρων ηλεκτροδιάτρησης, καταλήγοντας στις παρακάτω συνθήκες: ένταση του ηλεκτρικού πεδίου 250 Volt/cm, συνολική διάρκεια των ηλεκτρικών παλμών 25 msec - (2–3) παλμοί και το διάλυμα ηλεκτροδιάτρησης για κυτταροκαλλιέργειες ως το μέσο στο οποίο εφαρμόζεται το ηλεκτρικό ρεύμα. Επιβεβαίωση ότι οι παραπάνω συνθήκες ηλεκτροδιάτρησης δεν επηρεάζουν το αναπτυξιακό πρόγραμμα της χοριογένεσης των ωοθυλακίων καθώς αναπτύσσονται σε in vitro καλλιέργειες, προήλθε από πειράματα ανάλυσης κηλίδων RNA με χρήση μη κατεργασμένων ωοθυλακίων, ωοθυλακίων που επωάστηκαν σε θρεπτικό υλικό και ωοθυλακίων που επωάστηκαν σε θρεπτικό υλικό μετά από εφαρμογή ηλεκτρικών παλμών. Το ίδιο συμπέρασμα προέκυψε έπειτα από σύγκριση των προτύπων έκφρασης, μέσω ηλεκτροδιάτρησης, των γονιδιακών κατασκευών με τους άρτιους (πλήρους μήκους) υποκινητές p5H4, pEr1, p6F6.2, pL9, pL1 και των προτύπων μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων, μέσω πειραμάτων ανάλυσης κηλίδων RNA, που είναι γνωστά από τη βιβλιογραφία. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος της «αρχιτεκτονικής» του «διφασικού» υποκινητή του γονιδιακού ζεύγους Α/Β.L9 στη ρύθμιση της μεταγραφής, προς οποιαδήποτε κατεύθυνση. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα ηλεκτροδιάτρησης γονιδιακές κατασκευές του υποκινητή pL9, μεταλλαγμένου σε διάφορες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Μεταλλαγή της θέσης πρόσδεσης GATA έδειξε ότι ο παράγοντας δρα ως καταστολέας της έκφρασης, κατά τα πρώιμα στάδια της χοριογένεσης, στον υποκινητή pL9. Επιπλέον, μεταλλαγή των θέσεων πρόσδεσης του παράγοντα HMGA κατέστησε τον υποκινητή ανίκανο να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή σε οποιοδήποτε αναπτυξιακό στάδιο. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν αναμενόμενο, καθώς ο μεταγραφικός παράγοντας HMGA έχει δειχθεί ότι είναι υπεύθυνος τόσο για την κάμψη του υποκινητή όσο και για την προσέλκυση του «ενεργοποιητικού» παράγοντα C/EBP, επιβεβαιώνοντας, με αυτόν τον τρόπο, τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει στην έναρξη της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων του χορίου. Τα δύο αυτά αποτελέσματα αποτέλεσαν, επίσης, απόδειξη ότι η μέθοδος της ηλεκτροδιάτρησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των cis- ρυθμιστικών στοιχείων ενός υποκινητή, εφόσον γίνεται σύγκριση μόνο των προτύπων έκφρασης που προκύπτουν από τις διαφορετικές παραλλαγές του ιδίου υποκινητή μεταξύ τους. Τέλος, μεταλλαγή σε μεμονωμένες θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα C/EBP (αλλά και σε συνδυασμούς αυτών) έδειξε ότι από τις τέσσερις θέσεις C/EBP, που εντοπίζονται στον συγκεκριμένο υποκινητή, δύο είναι οι πιο σημαντικές (με αξιοσημείωτο το γεγονός ότι έχουν τον ίδιο προσανατολισμό): (α) Η θέση C/EBP2, η οποία «προτιμάται» έναντι της θέσης C/EBP1 (η κοντινή τους απόσταση δεν επιτρέπει την ταυτόχρονη πρόσδεση της πρωτεΐνης και στις δύο θέσεις), και (β) Η θέση C/EBP4, καθώς η μεταλλαγή της επηρεάζει την ενεργοποίηση της μεταγραφής σε αντίθεση με τη θέση C/EBP3, της οποίας ο ρόλος αποδείχτηκε ότι είναι «ουδέτερος». Από την παρούσα διατριβή προέκυψε ένα αναθεωρημένο πρότυπο για τη σωστή αναπτυξιακή ρύθμιση των Α/Β.L9 γονιδίων. Το πρότυπο αυτό περιλαμβάνει ένα αυστηρό πρόγραμμα πρόσδεσης -των προαναφερθέντων- μεταγραφικών παραγόντων σε συγκεκριμένα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, των οποίων η προσβασιμότητα εξαρτάται από δύο νουκλεοσώματα, παρόντα στον υποκινητή.

scholarly journals Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF56 encodes an occlusion-derived virus protein and is not essential for budded virus production

2008 ◽  
Vol 89 (5) ◽  
pp. 1212-1219 ◽  
Author(s):  
Hai-Jun Xu ◽  
Zhang-Nv Yang ◽  
Jin-Fang Zhao ◽  
Cai-Hong Tian ◽  
Jun-Qing Ge ◽  
...  
Keyword(s):  
Bombyx Mori ◽  
Cultured Cells ◽  
Virus Production ◽  
Core Gene ◽  
Virus Protein ◽  
Infected Cells ◽  
Budded Virus ◽  
Larval Bioassay

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF56 (Bm56) is a baculovirus core gene that is highly conserved in all baculoviruses that have had their genomes sequenced to date. Its transcripts in BmNPV-infected cells could be detected from 12 h post-infection (p.i.) and the encoded protein could be detected at 16 h p.i. by using a polyclonal antibody against glutathione S-transferase–Bm56 fusion protein. Western blot analysis showed that Bm56 is a structural component of the occlusion-derived virus nucleocapsid. Subsequent confocal microscopy revealed that Bm56 was distributed in the outer nuclear membrane and the intranuclear region of infected cells. To investigate the role of Bm56 in virus replication, a Bm56-knockout bacmid of BmNPV was constructed via homologous recombination in Escherichia coli. The Bm56 deletion had no effect on budded virus (BV) production in cultured cells; however, the deletion affected occlusion-body morphogenesis. A larval bioassay demonstrated that the Bm56 deletion did not reduce infectivity, whereas it resulted in a 50 % lethal time that was 16–18 h longer than that of the wild-type bacmid at every dose used in this study. These results indicate that Bm56 facilitates efficient virus production in vivo; however, it is not essential for BV production in vitro.

The validation of the role of several genes related to Bombyx mori nucleopolyhedrovirus infection in vivo

2021 ◽  
Vol 106 (2) ◽  
Author(s):  
Xue‐yang Wang ◽  
Chun‐xiao Zhao ◽  
Xin Wang ◽  
Zi‐qin Zhao ◽  
Zhi‐hao Su ◽  
...  
Keyword(s):  
Bombyx Mori ◽  
Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus

scholarly journals Bombyx mori nucleopolyhedrovirus BmP95 plays an essential role in budded virus production and nucleocapsid assembly

2013 ◽  
Vol 94 (7) ◽  
pp. 1669-1679 ◽  
Author(s):  
Xingwei Xiang ◽  
Yunwang Shen ◽  
Rui Yang ◽  
Lin Chen ◽  
Xiaolong Hu ◽  
...  
Keyword(s):  
Bombyx Mori ◽  
Virus Production ◽  
Full Length ◽  
Tubular Structures ◽  
Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus ◽  
Budded Virus ◽  
Conserved Gene ◽  
Fluorescence And Light Microscopy

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) BmP95 is a highly conserved gene that is found in all of the baculovirus genomes sequenced to date and is also found in nudiviruses. To investigate the role of BmP95 in virus infection in vitro, a BmP95 deletion virus (vBmP95-De) was generated by homologous recombination in Escherichia coli. Fluorescence and light microscopy and titration analysis indicated that the BmP95 deletion bacmid led to a defect in production of infectious budded virus (BV). However, deletion of BmP95 did not affect viral DNA replication. Electron microscopy showed that masses of aberrant tubular structures were present in cells transfected with the BmP95 deletion bacmid, indicating that deletion of BmP95 affected assembly of the nucleocapsid. This defect could be rescued by insertion of full-length BmP95 into the polyhedrin locus of the BmP95-knockout bacmid but not the N-terminal domain of BmP95. Together, these results showed that full-length BmP95 is essential for BV production and is required for nucleocapsid assembly.

scholarly journals Hemolymph Melanization in the Silkmoth Bombyx mori Involves Formation of a High Molecular Mass Complex That Metabolizes Tyrosine

2013 ◽  
Vol 288 (20) ◽  
pp. 14476-14487 ◽  
Author(s):  
Kevin D. Clark ◽  
Michael R. Strand
Keyword(s):  
Complex Formation ◽  
Bombyx Mori ◽  
Gel Filtration ◽  
High Molecular Mass ◽  
Mass Spectrometry Analysis ◽  
High Mass ◽  
Wound Site ◽  
Spectrometry Analysis

The phenoloxidase (PO) cascade regulates the melanization of blood (hemolymph) in insects and other arthropods. Most studies indicate that microbial elicitors activate the PO cascade, which results in processing of the zymogen PPO to PO. PO is then thought to oxidize tyrosine and o-diphenols to quinones, which leads to melanin. However, different lines of investigation raise questions as to whether these views are fully correct. Here we report that hemolymph from the silkmoth, Bombyx mori, rapidly melanizes after collection from a wound site. Prior studies indicated that in vitro activated PPO hydroxylates Tyr inefficiently. Measurement of in vivo substrate titers, however, suggested that Tyr was the only PO substrate initially present in B. mori plasma and that it is rapidly metabolized by PO. Fractionation of plasma by gel filtration chromatography followed by bioassays indicated that melanization activity was primarily associated with a high mass complex (∼670 kDa) that contained PO. The prophenoloxidase-activating protease inhibitor Egf1.0 blocked formation of this complex and Tyr metabolism, but the addition of phenylthiourea to plasma before fractionation enhanced complex formation and Tyr metabolism. Mass spectrometry analysis indicated that the complex contained PO plus other proteins. Taken together, our results indicate that wounding alone activates the PO cascade in B. mori. They also suggest that complex formation is required for efficient use of Tyr as a substrate.

Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Bacmid Enabling Rapid Generation of Recombinant Virus by In Vitro Transposition

2015 ◽  
Vol 25 (3) ◽  
pp. 386-392
Author(s):  
Xue Ying Tao ◽  
Jae Young Choi ◽  
Yang-Su Kim ◽  
Seok Hee Lee ◽  
Saes Byeol An ◽  
...  
Keyword(s):  
Bombyx Mori ◽  
Recombinant Virus ◽  
Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus ◽  
Rapid Generation ◽  
In Vitro Transposition
Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document