Chemosensitizing effects of methyl jasmonate on paclitaxel-resistant androgen-dependent and independent prostate cancer cell lines

The taxane-based therapy provides survival benefit in patients with metastatic prostate cancer; however, the average survival is less than 20 months due to the partial taxane-related chemoresistance. Innovative strategies are needed to overcome the chemoresistance for improved patient survival. In this project, paclitaxel-resistance was developed on androgen-independent PC3 and androgen-dependent 22Rv1 and LNCaP human prostate cancer (PCa) cell lines to investigate the efficacy of methyl jasmonate (MeJa), an anti-cancer drug, in overcoming the chemoresistance. The PCa cell lines were maintained in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 37?C under 5% CO2. The cell lines were exposed to the gradually increasing doses of paclitaxel. Since the resistance on LNCaP could not be achieved, the study was continued with 22Rv1 cell line. It was demonstrated that paclitaxel-resistant cell lines overexpress ABCB1. Resistance levels of cells and MeJa activity in all resistant and parental lines were measured using CellTiter-Glo? luminescent assay. Test results were compared with Student?s t-test or analysis of variance (ANOVA). P?0.05 (two-tailed) was considered to be significant. In conclusion, MeJa showed more cytotoxicity on paclitaxel resistant PC3 (PC3-PtxR) cells than resistant 22Rv1 (22Rv1-PtxR) cells. Detection of cytotoxic effects of MeJa in overcoming paclitaxel resistance may contribute to the development of alternative new compounds for the prevention or chemosensitization of resistance to chemotherapeutics such as paclitaxel.

Antimycobacterial and PknB Inhibitory Activities of Venezuelan Medicinal Plants

Global control and elimination of tuberculosis are hindered by the high prevalence of drug-resistant strains, making the development of new drugs to fight tuberculosis a public health priority. In this study, we evaluated 118 extracts from 58 Venezuelan plant species for their ability to inhibit the growth of Mycobacterium tuberculosis mc26020, using the agar dilution method. Additionally, we determined the ability of these extracts to inhibit the activity of PknB protein, an essential M. tuberculosis serine/threonine kinase, using a high-throughput luminescent assay. Of the 118 extracts tested, 14 inhibited bacterial growth with a minimum inhibitory concentration ≤500 μg/ml, and 36 inhibited the kinase activity with a half-maximal inhibitory concentration <200 μg/ml. Five extracts inhibited M. tuberculosis growth and inhibited the activity of the kinase protein, suggesting that this could be the basis of their growth inhibition.

Genetically encoded split luciferase biosensors to measure endosome disruption in real time in live cells

Endosomal escape is a critical step in intracellular delivery of biomacromolecular drugs, but quantitative, high throughput study of endosomal vesicle disruption remains elusive. We designed two genetically encoded split luciferase “turn on” reporters that can be assayed rapidly in well plates on live cells using a luminometer. Both systems use non-luminescent N-terminal and C-terminal luciferase fragments which can reconstitute a functional luminescent enzyme when they are held in proximity by their fusion partners. The first system uses Gal8 and CALCOCO2 fused to these fragments, which interact following endosome disruption and facilitate complementation of the split luciferase fragments to produce significant luminescence when luciferin is added. The second system uses the N-terminal carbohydrate recognition domain of Gal8 (G8-NCRD) fused to both luciferase fragments. Following endosome disruption, G8-NCRD binds to exposed glycans inside endosomes, concentrating both fragments there to reconstitute active luciferase. Additionally, and in contrast to recently reported Gal8 intracellular tracking with fluorescent microscopy, these split luciferase-based assays enable simultaneous identification and downselection of cytotoxic test conditions because the luciferase reaction requires intracellular ATP. Further, we demonstrate that the lead luminescent cell line is more sensitive to detection of endosomal disruption at lower doses of an endosome disrupting drug carrier than the previously reported Gal8-YFP fluorescent system. These systems represent a first-in-class luminescent assay to detect endosome disruption in high throughput while excluding toxic formulations. Endosome disruption screening with these “turn on” systems has potential as a tool in the discovery and development of intracellular biologic drug delivery formulations.Graphical Abstract

Feasibility of Using a Luminescence-Based Method to Determine Serum Bactericidal Activity against Neisseria gonorrhoeae

Development of a vaccine to limit the impact of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae is now a global priority. Serum bactericidal antibody (SBA) is a possible indicator of protective immunity to N. gonorrhoeae, but conventional assays measure colony forming units (CFU), which is time-consuming. A luminescent assay that quantifies ATP as a surrogate measure of bacterial viability was tested on N. gonorrhoeae strains FA1090, MS11 and P9-17 and compared to CFU-based readouts. There was a linear relationship between CFU and ATP levels for all three strains (r > 0.9). Normal human serum (NHS) is a common source of complement for SBA assays, but needs to be screened for non-specific bactericidal activity. NHS from 10 individuals were used for serum sensitivity assays—sensitivity values were significantly reduced with the ATP method for FA1090 (5/10, p < 0.05) and MS11 (10/10, p < 0.05), whereas P9-17 data were comparable for all donors. Our results suggest that measuring ATP underestimates serum sensitivity of N. gonorrhoeae and that the CFU method is a better approach. However, mouse anti-P9-17 outer membrane vesicles (OMV) SBA titres to P9-17 were comparable with both methods (r = 0.97), suggesting this assay can be used to rapidly screen sera for bactericidal antibodies to gonococci.

A High-Resolution Luminescent Assay for Rapid and Continuous Monitoring of Protein Translocation Across Biological Membranes

ABSTRACTProtein translocation is a fundamental process in biology. Major gaps in our understanding of this process arises due the poor sensitivity, low time-resolution and irreproducibility of translocation assays. To address this, we applied NanoLuc split-luciferase to produce a new strategy for measuring protein transport. The system reduces the timescale of data collection from days to minutes, and allows continuous acquisition with a time-resolution in the order of seconds – yielding kinetics parameters suitable for mechanistic elucidation and mathematical fitting. To demonstrate its versatility, we implemented and validated the assay in vitro and in vivo for the bacterial Sec system, and the mitochondrial protein import apparatus. Overall, this technology represents a major step forward, providing a powerful new tool for fundamental mechanistic enquiry of protein translocation and for inhibitor (drug) screening, with an intensity and rigour unattainable through classical methods.

Διαχρονικές μεταβολές βιοενέργειας, μεταβολισμού και ανοσολογικής απόκρισης στην οξεία φάση της σοβαρής σήψης

Εισαγωγή: Το κυτταρικό στρες από σοβαρή σήψη (severe sepsis, SS) ή σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (Systemic inflammatory response syndrome, SIRS) εκδηλώνεται με οξείες φλεγμονώδεις, ορμονικές, ανοσολογικές και μεταβολικές διαταραχές. Η συσχέτισή τους με πιθανή δυσλειτουργία μιτοχονδρίων δεν έχει επαρκώς μελετηθεί. Σκοπός: Σκοπός της μελέτης ήταν η εκτίμηση των διαχρονικών μεταβολών φλεγμονώδους-ορμονικής αντίδρασης, ενδογενούς-ανοσίας, βιοενέργειας και μεταβολισμού σε ασθενείς, ενήλικες και παιδιά, με σοβαρή σήψη (SS) και η σύγκριση με αντίστοιχες ομάδες ασθενών με SIRS και υγιών (H), ενηλίκων και παιδιών.Υλικά/Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 68 παιδιά (SS/18, SIRS/23, H/27) και 79 ενήλικες (SS/23, SIRS/23, H/33) διαχρονικά, την 1, 3η και 5η ημέρα νοσηλείας. Υπολογίστηκαν ο δείκτης μάζας σώματος (Body mass index (BMI) z-scores) και τα scores βαρύτητας νόσου (PeLOD, APACHE, TISS, SOFA). Μετρήθηκαν η καρδιακή συσταλτικότητα (EF, SF), η τροπονίνη (Tn), το γαλακτικό οξύ, η κατανάλωση ενέργειας (Energy expenditure, EE) με Gas Module E-COVX, το ATP στα λευκά αιμοσφαίρια με δοκιμασία λουσιφεράσης (luciferase luminescent assay), τα επίπεδα γλουταμίνης και NO2/NO3 με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), τα προϊόντα υπεροξείδωσης λιπιδίων (TBARS) με χρωματομετρική δοκιμασία, η ρεζιστίνη, η αντιπονεκτίνη ορού και οι εξωκυττάριες Heat Shock Proteins (HSP) με την ποσοτική ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA (sandwich enzyme-linked immunosorbent assay), και οι ενδοκυττάριες HSP72, HSP90α με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry). Αποτελέσματα: Διαχρονικά τόσο σε ενήλικες (ICU) όσο και σε παιδιά (PICU) οι τιμές ρεζιστίνης, αντιπονεκτίνης, εξωκυττάριας HPS72 και 90α παρουσιάζαν σταθερό πρότυπο διέγερσης σε όλη την οξεία φάση των 5 ημέρων. Στη χρονική αυτή περίοδο, οι παράμετροι μεταβολισμού VO2, VCO2, EE παρουσίασαν σταθερό υπομεταβολικό προφίλ, ίδιο σε ενήλικες και παιδιά. Η αυξημένη έκφραση των NO3, NO2, TBARS και αντιπονεκτίνης στη σήψη παρουσίασαν μια πιο ασταθή εικόνα όσον αφορά τη διαχρονική τους έκφραση ανά ηλικιακή ομάδα.Η βιοενέργεια των μιτοχονδρίων ήταν διαχρονικά μειωμένη σε ενήλικες κα παιδιά που δεν επιβίωσαν σε σχέση με εκείνους που επιβίωσαν, και συνοδεύονταν από σημαντικά μειωμένο μεταβολισμό και υπομεταβολικά πρότυπα την 3η και 5η ημέρα (p<0.05). Οι ασθενείς που επιβίωσαν παρουσίαζαν σημαντική διαφοροποίηση των αρχικών τιμών BVR, γαλακτικού, ΕΕ, VO2, VCO2 και μεταβολικού προφιλ σε σύγκριση με ασθενείς που πέθαναν, οι οποίοι έδειξαν αδυναμία ανάκαμψης του υπομεταβολισμού ή της αντιοξειδωτικής κατάστασης την 5η ημέρα. Συμπέρασμα: Η SS χαρακτηρίζεται διαχρονικά, από ισχυρότερη ενδοκυττάρια καταστολή μεταβολισμού, μείωση κατανάλωσης ενέργειας, μείωση των ATP, HPS72, HSP90α, αλβουμίνης, γλουταμίνης και εξωκυττάρια αύξηση φλεγμονωδών ορμονών, ρεζιστίνης και αντιπονεκτίνης και πρωτεϊνών έμφυτης ανοσίας (HSP72). Μια πρώιμη κατάσταση υπομεταβολισμού, με καταστολή βιοενέργειας και ενδογενούς ανοσίας, η οποία και παραμένει διαχρονικά μαζί με συνεχιζόμενη κατάσταση φλεγμονής, με διαχρονικά αυξημένες μεταβολικές ορμόνες και πρωτείνες eHSP72/HSP90α, φαίνεται να ξεχωρίζει τη σήψη από το SIRS, και συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο θανάτου.Λέξεις κλειδιά: σήψη, SIRS, βιοενέργεια, HSP, μιτοχόνδρια, μεταβολισμός, θερμιδομετρία, αμινοξέα, οξείδιο του αζώτου, ATP, ρεζιστίνη, αντιπονεκτίνη, τραύμα