Τρανσκριπτομική και πρωτεομική ανάλυση του σημαντικότερου παράσιτου της ελιάς, του εντόμου Bactrocera oleae, με έμφαση στα συστήματα φυλοδιαχωρισμού και ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα

Το έντομο Bactrocera oleae (Tephritidae), κοινώς ο δάκος της ελιάς, είναι ο σημαντικότερος εχθρός της ελιάς και η ζημιά που προκαλεί φτάνει το 30% ετησίως. Οι καταστροφικές του συνέπειες τον καθιστούν στόχο συστηματικού ελέγχου, κυρίως με χρήση χημικών εντομοκτόνων. Για την καταπολέμηση του εντόμου στη χώρα μας χρησιμοποιούνται κυρίως οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα, ενώ σε μικρότερη κλίμακα εφαρμόζονται οι συνθετικές πυρεθρίνες και πρόσφατα ο νατουραλίτης spinosad. Η μη ορθολογική χρήση αυτών εμπεριέχει κινδύνους, όπως οικολογικές διαταραχές, δημιουργία και εξάπλωση ανθεκτικότητας, επιβλαβείς τοξικολογικές επιδράσεις και συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου. Για τον έλεγχο φυσικών πληθυσμών του εντόμου έχουν προταθεί νέες φιλικότερες προς το περιβάλλον μέθοδοι, όπως η τεχνική του στείρου εντόμου (Sterile Insect Technique, SIT) που προϋποθέτει τη μαζική εκτροφή και εξαπόλυση στείρων εντόμων στη φύση. Η μέθοδος αυτή έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τον έλεγχο άλλων εντόμων (πχ. Μεσογειακή μύγα) σε διάφορες περιοχές του κόσμου, ωστόσο η SIT δεν έχει εφαρμοσθεί με επιτυχία ακόμη στον δάκο. Όπως έχει δειχθεί σε πολλές περιπτώσεις, η επιτυχής εφαρμογή της SIT προϋποθέτει καλή γνώση της βιολογίας και της οικολογίας του εντόμου, καθώς και αποτελεσματικά μοριακά και γενετικά εργαλεία. Δεδομένου ότι οι πληροφορίες για το γονιδίωμα του δάκου είναι ελάχιστες, η παρούσα έρευνα έχει σκοπό την ανάπτυξη εργαλείων πρωτεομικής και τρανσκριπτομικής που θα βοηθήσουν τις προσπάθειες αποτελεσματικότερης εφαρμογής SIT και τον εντοπισμό και την απομόνωση γονιδίων του δάκου που εμπλέκονται είτε σε μονοπάτια φυλοδιαχωρισμού είτε ανθεκτικότητας στο εντομοκτόνο spinosad. Τρανσκριπτομική ανάλυση: Η ανάλυση του τρανσκριπτώματος του δάκου στόχευε αφενός στην αποκάλυψη γενετικών τόπων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του δάκου στο spinosad και αφετέρου στον εντοπισμό γονιδίων διαχωρισμού των δύο φύλων. Για το σκοπό αυτό, RNA απομονώθηκε είτε από κεφάλια ανθεκτικών και ευαίσθητων στο spinosad εντόμων, είτε από το αναπαραγωγικό σύστημα αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Το RNA αυτό μετατράπηκε σε cDNA και ακολούθησε η αλληλούχησή του. Η αλληλούχηση πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Φλέμινγκ με την τεχνολογία SOLiD. Η βιοπληροφορική ανάλυση των δειγμάτων κατέληξε σε πλήθος γονιδίων διαφορετικής έκφρασης σε ευαίσθητα και ανθεκτικά στο spinosad έντομα καθώς επίσης και σε αρσενικά και θηλυκά άτομα B. oleae. Η επεξεργασία και σύγκριση περισσότερων από 13.000 γονιδίων προσδιόρισε τη στατιστικά σημαντική υπερέκφραση 9 γονιδίων και στατιστικά σημαντική υποέκφραση ~40 γονιδίων ανάμεσα σε ευαίσθητα και ανθεκτικά στο spinosad έντομα. Αντίστοιχα, 330 γονίδια είχαν υπερέκφραση στα θηλυκά έντομα ενώ 1238 υπερεκφράζονται στα αρσενικά έντομα. Στη συνέχεια επιλέχθηκαν είτε γονίδια με ιδιαίτερα διαφορετική έκφραση είτε γονίδια ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση μέσω qRT-PCR. Για τη λειτουργική ανάλυση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε θηλυκά και αρσενικά άτομα μελετήθηκαν οι δώδεκα γενετικοί τόποι: kl2 (male fertility factor, kl2), kl3 (male fertility factor, kl3), kl5 (male fertility factor, kl5), ory (occludin-related Y protein), fem-1 (sex-determining protein fem-1), gas8 (growth arrest specific protein 8), lobo (lost boys),ix (intersex), pbl (pebble) και hcf (host cell factor C1) που υπερεκφράζονται στα αρσενικά και τα δύο γονίδια sox και pcp (pupal cuticle protein 78E) που υπερεκφράζονται στα θηλυκά έντομα. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε σημαντική διαφορά αυξημένης έκφρασης στα αρσενικά έντομα για τα γονίδια kl2, kl3, kl5, ory, fem-1, gas8, lobo, pbl, hcf και το γονίδιο pcp με υπερέκφραση στα θηλυκά έντομα ενώ ελάχιστες διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των αρσενικών και θηλυκών εντόμων για το γονίδιο ix. Μόνο για το γονίδιο sox δεν διαπιστώθηκε το αναμενόμενο αποτέλεσμα. Παράλληλα, για τη λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα, συνολικά μελετήθηκαν δύο ανθεκτικοί και δύο ευαίσθητοι πληθυσμοί B. oleae. Οι ανθεκτικοί πληθυσμοί ήταν ο εργαστηριακός πληθυσμός (SPIN) που είχε επιλεγεί μέσω συνεχούς προσθήκης του εντομοκτόνου στη διατροφή του και ένας φυσικός πληθυσμός από την Καλιφόρνια (w-CAL) που εμφάνιζε 13 φορές αυξημένη ανθεκτικότητα σε σχέση με εργαστηριακό ευαίσθητο στέλεχος. Οι ευαίσθητοι πληθυσμοί ήταν ο εργαστηριακός (LΑΒ) που εκτρέφεται σε εργαστηριακές συνθήκες τα τελευταία ~40 χρόνια και ένας πληθυσμός που προέκυψε από ελαιόκαρπους της περιοχής Βόλου- Αγριάς (w-GR) όπου δεν γίνεται χρήση εντομοκτόνων. Συνολικά μελετήθηκαν οι δεκαέξι γενετικοί τόποι που αρκετοί ανήκουν σε ομάδες μεταβολισμού ενέργειας: Yolk protein 2 (Yp2), ATP synthase FO subunit 6 (ATP synthase), Low affinity cationic amino acid transporter 2 (CAT-2), Serine protease 6 (SP6), 4-nitrophenylphophatase (pNPPase), Salivary Cys-rich secreted peptide-vWF (SalCys), Cytochrome P450 6a23-like (Cyp6α23) και Antigen 5 precursor (Ant5) που υπερεκφράζονται στα ανθεκτικά στο spinosad έντομα και Heat-shock protein 70 (Hsp70), Heat-shock protein 23 (Hsp23), Larval serum protein 1 (LSP1), HexamerinL1 (HexL1), Chitinase 5 (Cht5), Oxidase/peroxidase (oxidase), Macrophage mannose receptor 1 (mmr1) και Cell division cycle-associated protein 7 (Cdc) που υποεκφράζονται στα ανθεκτικά έντομα. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε σημαντική διαφορά αυξημένης έκφρασης στα ανθεκτικά έντομα για τα γονίδια Yp2, ATPsynthase, CAT-2, SP6, pNPPase, SalCys και Cyp6α23 αλλά και των γονιδίων Hsp70, Hsp23, LSP1, HexL1, Cht5 με υπερέκφραση στα ευαίσθητα έντομα. Για τα γονίδια Ant5, oxidase, mmr1 και Cdc δεν διαπιστώθηκε το αναμενόμενο αποτέλεσμα. Πρωτεομική ανάλυση: Για την πρωτεομική ανάλυση, αρχικά πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (2D-PAGE) σε κεφάλια από αρσενικά και θηλυκά έντομα για τη μελέτη της διαφορικής έκφρασης των πρωτεϊνών μεταξύ των δύο φύλων του δάκου. Στη συνέχεια, οι διαφορετικές πρωτεΐνες εντοπίστηκαν, αποκόπηκαν, ακολούθησε πέψη με τρυψίνη και ανάλυση με φασματομετρία μάζας στο ινστιτούτο Αλέξανδρος Φλέμινγκ. Τέλος, τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης, όπου προέκυψαν πρωτεΐνες που εκφράζονται με διαφορετικό τρόπο ανάμεσα σε θηλυκά και αρσενικά έντομα. Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν σε διαφορετικές λειτουργικές ομάδες όπως κυτοσκελετού, μεταβολισμού, συναπτοσωμικές, μεταγωγής σήματος και οξειδωτικού στρες. Επίσης, έγινε εφαρμογή μιας νέας προσέγγισης μέσω μελέτης των πεπτιδίων. Με σκοπό τη διερεύνηση μηχανισμών που εμπλέκονται σε συστήματα φυλοδιαχωρισμού, αρχικά συλλέχθηκαν όργανα αναπαραγωγής αρσενικών και θηλυκών εντόμων από το εργαστηριακό στέλεχος του δάκου. Στη συνέχεια, έγινε ομογενοποίηση των ιστών με κατάλληλο διάλυμα λύσης και απομόνωση των πεπτιδίων. Ακολούθησε η φασματομετρία μάζας με χρήση MALDI TOF-TOF, λήψη των αποτελεσμάτων των πεπτιδίων με τη χρήση του MASCOT και επεξεργασία των αποτελεσμάτων μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης. Με επιτυχία έγινε εντοπισμός πεπτιδίων που εμπλέκονται σε συστήματα διαχωρισμού των δύο φύλων καθώς παρατηρήθηκε υπερέκφραση τους σε αρσενικά και θηλυκά έντομα αντίστοιχα.

An inverse PCR screen for the detection of P element insertions in cloned genomic intervals in Drosophila melanogaster.

We developed a screening approach that utilizes an inverse polymerase chain reaction (PCR) to detect P element insertions in or near previously cloned genes in Drosophila melanogaster. We used this approach in a large scale genetic screen in which P elements were mobilized from sites on the X chromosome to new autosomal locations. Mutagenized flies were combined in pools, and our screening approach was used to generate probes corresponding to the sequences flanking each site of insertion. These probes then were used for hybridization to cloned genomic intervals, allowing individuals carrying insertions in them to be detected. We used the same approach to perform repeated rounds of sib-selection to generate stable insertion lines. We screened 16,100 insert bearing individuals and recovered 11 insertions in five intervals containing genes encoding members of the kinesin superfamily in Drosophila melanogaster. In addition, we recovered an insertion in the region including the Larval Serum Protein-2 gene. Examination by Southern hybridization confirms that the lines we recovered represent genuine insertions in the corresponding genomic intervals. Our data indicates that this approach will be very efficient both for P element mutagenesis of new genomic regions and for detection and recovery of "local" P element transposition events. In addition, our data constitutes a survey of preferred P element insertion sites in the Drosophila genome and suggests that insertion sites that are mutable at a rate of approximately 10(-4) are distributed every 40-50 kb.