Antibiotic-potentiation activities of three animal species extracts, Bitis arietans, Helix aspersa, and Aristaeomorpha foliacea and mode of action against MDR Gram-negative bacteria phenotypes

Background: In recent years, drug resistance to human pathogenic bacteria has been commonly reported from all over the world. As antimicrobial activities of most medicinal plants and antibiotics have been already explored, it is more important to make investigations on animal species mainly invertebrates which could constitute an efficient source of antimicrobial molecules. This work was aimed at contributing to the fight against microbial resistance through the study of antibacterial potential of three animal species (Helix aspersa, Bitis arietans, Aristaeomorpha foliacea) on several multidrug-resistant (MDR) Gram-negative strains overexpressing efflux pumps including Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Methods: The microdilution technique was used to evaluate the antibacterial activities of the tested samples by determining their minimal inhibitory concentrations (MICs), as well as the effect of their combination with antibiotics. Studies on the mechanisms of action of the most active sample, dried Bitis arietans extract, was carried out using standard methods for evaluating the effects of this extract on bacterial H+-ATPases-mediated proton pumps and on bacterial growth kinetics. In this latter case, the optical density was read spectrophotometrically. Results: Zoochemical screening indicated the presence of protein constituents and alkaloids and the absence of other metabolites in all tested extracts. Dried B. arietans showed the best antibacterial activity by inhibiting the growth of 90% of studied bacterial strains with MICs ranging from 128 to 2048 μg/ml. Moreover, this extract presented a significant activity (100≤MIC≤512 µg/ml) against 35% of bacteria that are E. coli (ATCC8739, AG100ATet, MC4100), E. aerogenes EA27, K. pneumoniae ATCC11296, P. aeruginosa (PA01, PA124) and a moderate activity (512<MIC≤2048 µg/ml) against 55% of studied bacteria. It was followed by fresh B. arietans which inhibited the growth of 65% of bacteria with significant activity on three bacteria (E. coli ATCC8739, E. aerogenes ATCC13048 and K. pneumoniae ATCC11296. These two extracts showed bactericidal effects on many strains. The other extracts samples selectively exhibited an antibacterial activity against less than 40% of strains. All samples potentiated the activity of at least 56% of used antibiotics against at least 70% of studied bacterial strains. B. arietans extracts at MIC/2 and MIC/4 mostly improved the activities of more than 78% of antibiotics on at least 70% of bacteria with improvement activity factors (IAF) ranging from 2 – 128 suggesting that this animal contains bioactive compounds which could act as efflux pumps inhibitors. Bacterial growth kinetic study showed that when treated with dried B. arietans extract (the most active sample) at different concentrations MIC/2, MIC and 2xMIC, the growth of tested bacteria (E. coli ATCC8739) decreased respectively when the concentrations increased. Furthermore, this extract inhibited the H+-ATPase-mediated proton pumps of this bacterium increasing the pH values. Conclusion: Results obtained in the present work provide interesting data for the use of dried B. arietans extract and invertebrates in general in the traditional therapy for the treatment of bacterial infections involving multidrug-resistant phenotypes. Keywords: Gram-negative bacteria; multidrug resistance; efflux pumps; infectious diseases; animal species; secondary metabolites.

Exploring relationships between the distribution of giant red shrimp Aristaeomorpha foliacea (Risso, 1827) and environmental factors in the Central-Western Mediterranean Sea

Mediterranean giant red shrimp Aristaeomorpha foliacea (Risso, 1827) is one of the dominant species in deep-sea megafaunal assemblages, plays a key role in deep-sea communities and it is considered one of the most important targets of deep-water trawl fishing. Although a large number of studies have analysed the spatial distribution of epibenthic crustaceans in bathyal habitats with respect to environmental, geomorphological and hydrological factors, as well as fishing pressure, the manner in which these variables synergistically affect the spatio-temporal changes of giant red shrimp is unclear. To analyse the possible effects of abiotic predictors on the spatio-temporal distribution of giant red shrimp, Generalized Additived Models (GAMs) and Regression Trees were produced. Biological data were collected during the MEDITS trawl surveys carried out in the Sea of Sardinia (2009-2014), during which environmental data were obtained with a multiparametric probe. A longitudinal (west-east) trend was found, with higher abundances at depths of 400-600 m, corresponding to salinity values of 38.1-38.5 psu and temperatures of 13.6-13.8°C. Our results confirm the existence of a tight linkage between the distribution of the Levantine Intermediate Water (LIW) from the eastern Mediterranean Sea and the preferential habitat characteristics of the giant red shrimp. We suggest that a deeper knowledge of the relationships between abiotic (hydrological) factors in the water column and the distribution of Mediterranean resources, such as the giant red shrimp, can provide valuable support for their better management, at the local scale (Sardinia) and across the whole Mediterranean Sea.

Effects of ascorbic acid and erythorbic acid on melanosis and quality in different shrimp species

With this study, ascorbic acid and erythorbic acid were used for the first time to prevent melanosis in shrimp. Three shrimp species (Aristaeomorpha foliacea, Plesionika edwardsi and Melicertus hathor) were used. It was determined that melanosis scores were higher in the control groups. Combination of ascorbic acid and erythorbic acid with metabisulphite was found to be more effective in inhibiting of melanosis than the application alone. No significant differences were found between the groups in terms of TVB-N values. The TMA-N value of the control group was significantly higher than those of application groups. Ascorbic acid, Erythorbic acid and their combinations with sodium metabisulphite were found effective on inhibition of melanosis and quality changes in three shrimp species.Keywords: reducing agents; ascorbic acid; erythorbic acid; melanosis; quality; shrimp

Spatial and temporal patterns in the Mediterranean populations of Aristaeomorpha foliacea and Aristeus antennatus (Crustacea: Decapoda: Aristeidae) based on the MEDITS surveys

The aristeids Aristaeomorpha foliacea and Aristeus antennatus are two species of great economic importance in the Mediterranean Sea, where they are exploited almost exclusively by bottom trawlers. We analysed their geographical and inter-annual patterns using data collected, following a standardized protocol, during the MEDITS international experimental bottom trawl surveys. The data used consisted of standardized abundance and biomass indices, size structure and individual biological information collected in the northern Mediterranean for more than two decades. Several univariate and multivariate methodologies were used to analyse the data. The current study confirms previous findings, such as the longitudinal gradient in the relative presence of the aristeids, but also offers additional information for a better understanding of the intrinsic variability of the data over the years and between areas. Moreover, geographical variability in the somatic condition index is discussed, taking into account the role of environmental conditions and fishing pressure. The large geographical variability found for both species in this regional approach reflects the importance of additional studies at a small-scale geographical level. Such studies could be particularly important for managing and ensuring the stability of these species, for which large regional approaches may be inadequate.

The genus Gennadas (Benthesicymidae: Decapoda): morphology of copulatory characters, phylogeny and coevolution of genital structures

Species within Gennadas differ from each other largely only in male (petasma) and female (thelycum) copulatory characters, which were restudied in scanning electron microscopy and used as a basis for phylogenetic analyses. Twenty-six petasma characters and 49 thelycum characters were identified. All 16 recognized species of Gennadas and Aristaeomorpha foliacea (outgroup) were included as terminals. Four robust monophyletic clades were retrieved, described and diagnosed as new species groups. The thelycum characters had greater impact on tree topology and supported deeper nodes than did the petasma characters. We hypothesize that features of the thelycum evolved first followed by aspects of the petasma. Relatively more conservative characters include parts of the sternites of the thelycum and of the petasma, while the scuti and protuberances on the thelycum and the shape and subdivisions of the petasma lobes are evolutionarily plastic. We identified two groups of copulatory characters, which are likely coupled functionally and interlinked evolutionarily: (i) the external part of the petasma and the posterior part of the thelycum and (ii) the internal part of the petasma and anterior part of the thelycum. We reconstruct possible mating position during copulation for each of the new species groups presented here. We also present an updated key to genera of Benthesicymidae and key to species of Gennadas .

Προσδιορισμός λιπιδίων και μετάλλων σε βρώσιμα υδρόβια

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των λιπιδικών βιοδραστικών συστατικών όπως και των μετάλλων και μεταλλοειδών, τριών ειδών γαρίδων (Aristaeomorpha foliacea, Parapenaeus longirostris, Pandalus borealis). Οι γαρίδες παρουσιάζουν μεγάλο διατροφικό ενδιαφέρον, διότι αποτελούν σημαντική πηγή λειτουργικών λιπιδικών συστατικών, όπως ω-3 λιπαρών οξέων, καροτενοειδών, φωσφολιπιδίων, κλπ. τα οποία έχουν παράλληλα χρήση στην παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων διατροφής “nutraceutical”. Η παρουσία και σύσταση αυτώντων ουσιών εξαρτάται κυρίως από την ποιότητα και κατανάλωση του φυτοπλαγκτούζωοπλαγκτού και την περιοχή αλίευσης των γαρίδων. Επιπλέον στόχος ήταν η συγκριτική μελέτη των συστατικών αυτών στα συγκεκριμένα είδη γαρίδων. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν μέταλλα και μεταλλοειδή στις γαρίδες, ώστε να δοθεί ολοκληρωμένη εικόνα της διατροφικής αξίας των εν λόγω γαρίδων. Η εργασία αποτελείται από τέσσερα πειραματικά μέρη. Στο πρώτο πειραματικό μέρος(κεφάλαιο 6) αξιολογήθηκαν τα βιοδραστικά λιπιδικά συστατικά των μυών και των κεφαλοθωράκων των γαρίδων A. foliacea και P. longirostris. Εφαρμόσθηκαν διαφορετικές αναλυτικές μέθοδοι με κύριες τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC), την αεριοχρωματογραφία (GC) και την υγροχρωματογραφία (HPLC). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφατιδυλοχολίνη ήταν το κύριο λιπίδιο σε όλους τους ιστούς. Ως κύρια λιπαρά οξέα βρέθηκαν το παλμιτικό (C16:0), το ελαιϊκό (C18:1 ω-9 cis), το εικοσιπεντενοϊκό (C20:5 ω-3 cis, EPA) και το εικοσιδυοεξενοϊκό (C22:6 ω-3 cisDHA) οξύ, τόσο σε μύες όσο και σε κεφαλοθώρακες. Η αναλογία ω-3/ω-6 λιπαρών οξέων των μύων των Α foliacea και P. longirostris κυμάνθηκε σε τιμές >2.9, καθιστώντας τους μύες κατάλληλους για μια ισορροπημένη διατροφή. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) ήταν τα κύρια λιπαρά οξέα των μυών και των δύο ειδών, ενώ στους κεφαλοθώρακες επικρατέστερα ήταν τα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFA). Από τα καροτενοειδή, η ασταξανθίνη (αντιοδειξωτικό) βρέθηκε ως το κυριότερο συστατικό σε όλους τους ιστούς, και ακολούθησαν η λουτεΐνη, η κανθαξανθίνη, η ζεαξανθίνη, η α- και β-κρυπτοξανθίνη. Στο δεύτερο πειραματικό μέρος (κεφάλαιο 7), μελετήθηκαν συγκριτικά οι γαρίδες P. longirostris από τη θάλασσα της Κυλλήνη με τις P. borealis από τη θάλασσα Skagerrak (Δανία). Επίσης προσδιορίσθηκαν τα στοιχεία μόλυβδος (Pb), κάδμιο (Cd), ολικό αρσενικό (tΑs) μεφασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS), το οργανικό και ανόργανο αρσενικό με HPLC-ICPMS και ο υδραργύρος (Hg) με φασµατοµετρία ατοµικού φθορισμού ψυχρού ατµού (CVAFS). Στη συνέχεια προσδιορίστηκε και συγκρίθηκε το προφίλ των βιοδραστικών λιπαρών οξέων του ολικού λίπους των μυών και κεφαλοθωράκων των παραπάνω ειδών γαρίδων με GC-FID ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το tAs ήταν σε υψηλές συγκεντρώσεις σε όλους τους ιστούς,και κυρίως υπό την οργανική του μορφή. Αισθητά υψηλά επίπεδα Cd, βρέθηκαν στις γαρίδες P. borealis. Τέλος, οι ιστοί και των δύο ειδών περιείχαν σημαντικά ποσοστά των PUFA. Στο κεφάλαιο 8 (τρίτο πειραματικό μέρος), στόχος ήταν να μελετηθούν οι ιστοί των A. foliacea ως προς τη συγκέντρωση των στοιχείων Pb, Hg, Cd, tAs και Se. Έμφαση δόθηκε στην ανάλυση νέων ενώσεων Αs, των αρσενολιπιδίων (arsenolipids) με χρήση HPLC-ICPMS. Για πρώτη φορά δόθηκε το γενικό προφίλ των αρσενολιπίδιων σε γαρίδες, χωρίς όμως να επιτευχθεί η ειδοταυτοποίηση των ενώσεων αυτών. Στο κεφάλαιο 9 (τελευταίο πειραματικό μέρος) προσδιορίστηκαν τα απαραίτητα μέταλλα Mg, Fe, Zn, Mn, Cu, Cr και Νi και τα λιπαρά οξέα των ολικών, ουδετέρων και πολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων των γαρίδων A. foliacea. Υπολογίζοντας την ημερήσια πρόσληψη (ΕDI) των μετάλλων ανά 100 g γεύματος, οι τιμές των EDI βρέθηκαν χαμηλές στους μύες, ενώ στους κεφαλοθώρακες ήταν σε ικανοποιητικά επίπεδα. Εξαίρεση και ενδιαφέρον προκάλεσαν οι τιμές υψηλές συγκεντρώσεις του Cu, ο οποίος πιθανόν να σχηματίζει σύμπλοκα με την ασταξανθίνηπροσδίδοντας έντονο κόκκινο χρώμα στις A. foliacea. Εν κατακλείδι, οι διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των ειδών των γαρίδων οφείλονται σε ποικίλους παράγοντες, όπως στις διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές, τη βιοδιαθεσιμότητα των στοιχείων και των θρεπτικών συστατικών στο θαλασσινό νερό, στην έκδυση, το μέγεθος και το στάδιο ανάπτυξης των γαρίδων. Σύμφωνα όμως,με τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας, οι συγκεκριμένες γαρίδες καθίστανται κατάλληλες προς κατανάλωση και χρήση των λειτουργικών συστατικών τους σε συμπληρώματα διατροφής και άλλα προϊόντα.