Association of MUC2 and CYP11B2 genes single nucleotide polymorphisms with the external genital endometriosis development in female patients of the Slavic population of the Russian Northwestern Federal District

Aim. Search for the association of polymorphisms C(-15161)T (rs10902088) and T(-12150) C(rs10794288) of the MUC2 gene and С(-344)Т (rs1799998) of the CYP11B2 gene with the increased risk of genital endometriosis development in the Slavic population. Materials and methods. The study included 85 female patients (from 19 to 44 years old) with a diagnosis of genital endometriosis and 79 healthy women (from 20 to 42 years old). Genotyping was performed by real-time PCR using a Light Cycler 480 Instrument II amplifier (Roche, Switzerland). Polymorphism determination kits, MUC2 C(-15161)T (rs10902088), MUC2 T(-12150)C (rs10794288), CYP11B2 С(-344)Т (rs1799998) (CJSC Syntol). Results. It was found that the CC genotype of the T(-12150)C (rs10794288) C polymorphism of the MUC2 gene and the C(-344)T (rs1799998) CC polymorphism genotype of CYP11B2 gene are protective against endometriosis, and the TT genotype of C(-344)T polymorphism ( rs1799998) of the CYP11B2 gene contributes to the development of this disease. Conclusion. The search for molecular genetic aspects in the development of genital endometriosis is necessary for early diagnosis and prognosis of the disease.

Prevalensi Antibodi IgG dan DNA Cytomegalovirus pada darah donor di unit transfusi darah Provinsi DKI Jakarta

Indonesia has not conduct regular screening test of CMV infection due to the lack of seropositive prevelance data information. However, seronegative CMV results is not an indicator of safe blood for transfusion, so that another test that serves as confirmation test for CMV DNA is required. The aim of this study is to obtain prevalence data of CMV IgG antibody positive, the prevalence of CMV DNA positive and to determine the effect of CMV IgG titers against CMV DNA in blood donors in UTD PMI DKI Jakarta. Cross-sectional method was used to test 113 blood donor samples which have met inclusion criteria. Screening for CMV IgG antibody was held using indirect method chemiluminescence immunoassay (ChLIA) by Liason® XL 10050 Chemiluminescence Analyzer and CMV DNA analysis using qPCR method for the detection of CMV UL 54 with a tool Roche Light Cycler 480 II. Results indicate positive prevalence of IgG CMV in 111 samples (98.23%), and negative CMV IgG in 2 samples (1.77%). Prevalence of CMV DNA positive donors is one sample (0.88%), 112 negative CMV DNA samples (99.12%) and Fisher's test results {P (0.982)> α (0.05)} showed no significant association between CMV IgG status with CMV DNA. CONCLUSIONS: UTD DKI Jakarta has a high prevalence of CMV IgG with low prevalence of CMV DNA.

Αλλαγές στην έκφραση τύπων κολλαγόνου που σχηματίζουν ινίδια στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Εισαγωγή: Η έρευνα των μοριακών μηχανισμών στην ανάπτυξη του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου πνεύμονα (ΜΜΚΠ) μπορεί να αποδώσει βιολογικούς δείκτες για νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές. Η διήθηση του εξωκυττάριου δικτύου (ΕΚΔ) είναι κρίσιμο στάδιο στην επέκταση και την μετάσταση του καρκίνου.Έχει δειχθεί ότι οι αλλαγές στην έκφραση των κολλαγόνων σε κακοήθειες, ειδικά του κολλαγόνου ΧΙ, επηρεάζοντας την ικανότητα του όγκου για διήθηση και μετάσταση. Η αλυσίδα α1 του κολλαγόνου ΧΙ ελέγχεται από το γονίδιο COL11A1, η μεταγραφή του οποίου οδηγεί σε τέσσερεις ισομορφές της αλυσίδας α1 (A,Β,C και Ε). Η αλυσίδες αυτές διαφέρουν στην πρωτεόλυση του Ν-αμινοτελικού άκρου, με τρόπο που ευνοείται η διήθηση και η μετάσταση. Σκοπός της μελέτης είναι η ανάπτυξη νέων ποσοτικών μεθοδολογιών ανάλυσης για το γενικό μετάγραφο του COL11A1 και την ισομορφή C, η ποσοτικοποίηση όλων των ισομορφών στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα, κι η συσχέτιση για πρώτη φορά με ιστοπαθολογικούς προγνωστικούς παράγοντες στον καρκίνο του πνεύμονα. Μέθοδοι: Χειρουργικά δείγματα πνεύμονα από 23 ασθενείς με ΜΜΚΠ και 6 ασθενείς χωρίς καρκίνο, ελήφθησαν για την μελέτη της έκφρασης του κολλαγόνου ΧΙ(α1). Real-time RT-qPCR μεθοδολογίες με υβριδισμό διπλού probe αναπτύχθηκαν στην πλατφόρμα Light Cycler 1.5 (Roche, Germany). Τα μετάγραφα των ισομορφών του COL11A1 μετρήθηκαν σε cDNA από 27 δείγματα ιστού πνεύμονα (8 δείγματα ελέγχου και 19 δείγματα ιστού ΜΜΚΠ με γνωστά ιστοπαθολογικά δεδομένα). Η στατιστική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα IBM SPSS.Αποτελέσματα: Η ποσοτική αντίδραση RT-PCR έδειξε ότι το κολλαγόνο τύπου XI(α1) ήταν σημαντικά αυξημένο στα δείγματα του ΜΜΚΠ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P=0.004). Υπήρξε αύξηση της έκφρασης των επιπέδων mRNA του κολλαγόνου τύπου XI(α1) στο πρώιμο στάδιο Ι του ΜΜΚΠ. Κατά την περίοδο παρακολούθησης (1.5±0.5 έτη), οι ασθενείς που απεβίωσαν ή είχαν υποτροπή είχαν 8,5 φορές αύξηση των επιπέδων κολλαγόνου τύπου XI(α1) σε σύγκριση με 3,5 φορές αύξηση όσων είχαν επιζήσει χωρίς υποτροπή (P=0.009). Όλα τα 19 δείγματα του ΜΜΚΠ, που αναλύθηκαν για τις ισομορφές, ήταν θετικά για το γενικό μετάγραφο του COL11A1 (εύρος 11.2-1198.0 copies/μg ολικού RNΑ) ενώ 5 πό τα 8 δείγματα ελέγχου ήταν εντελώς αρνητικά. Η διαφορά των μέσων τιμών επίσης ήταν στατιστικά σημαντική (p<0.001). Σε 4 δείγματα ΜΜΚΠ (21%) δεν βρέθηκε μετάγραφο ισομορφής. Το μετάγραφο της ισομορφής C ανιχνεύθηκε μόνο σε 3 δείγματα όγκου. Όσον αναφορά τις ισομορφές A και E, 13 από τα 19 δείγματα ήταν θετικά για τουλάχιστον ένα από τα δύο (68%) και 11 και τα δύο (58%).Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η αυξημένη έκφραση του κολλαγόνου τύπου XI(α1) στον ΜΜΚΠ σχετίζεται με την πρόγνωση. Δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις συγκεκριμένων μετάγραφων ισομορφών με ιστοπαθολογικά δεδομένα που παρατηρήθηκαν, λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων. Δεδομένου ότι ο αριθμός των μετάγραφων ανά μg του COL11A1 υπερβαίνει τον συνολικό αριθμό των μετάγραφων των ισομορφών A+E+C σε όλα τα δείγματα, υπάρχει η προοπτική ανακάλυψης και ταυτοποίησης επιπλέον ισομορφών. Ο συγκεκριμένος δείκτης ενδεχομένως να έχει αξία στην επιλογή των ασθενών που θα ωφεληθούν από παραπέρα συμπληρωματική χημειοθεραπεία.

Μελέτη της πολυμορφίας του HCV στην Ελλάδα

Η ανακάλυψη και ταυτοποίηση του ιού HCV ως τον αιτιολογικό παράγοντα των περιστατικών μη-Α, μη-Β ηπατίτιδας ήταν η αρχή για την ανάπτυξη διαφόρων μεθόδων και τεχνολογιών για την ανίχνευση και τυποποίησή του. Ο ιός HCV ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae, γένος hepacivirus και το γονιδίωμά του είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας που κωδικοποιεί μια πολυπρωτεϊνη από την οποία προκύπτουν οι δομικές και οι μη δομικές πρωτεϊνες του. Κύτταρα-στόχοι του ιού – στα οποία εισέρχεται με ενδοκύτωση μετά από πρόσδεση σε ειδικούς υποδοχείς- είναι τα ηπατοκύτταρα αλλά αναφέρονται και τα λεμφοκύτταρα (Β και Τ) καθώς και τα δενδριτικά και τα μονοκύτταρα. Παρόλο που το ανοσοποιητικό σύστημα καταφέρνει να περιορίσει τη λοίμωξη και να οδηγήσει σε αυτοϊαση, εντούτοις ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών (80-85%) μεταπίπτουν σε χρονιότητα από τους οποίους το 5-25% θα φθάσουν σε στάδιο κίρρωσης διατρέχοντας τον κίνδυνο εμφάνισης ηπατικής νόσου τελικού σταδίου και ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Ο ιός HCV παρουσιάζει μεγάλη γενετική ετερογένεια, έχει παγκόσμια εξάπλωση και έχει μολύνει πάνω από 150 εκ. ανθρώπους στην υφήλιο. Διακρίνεται σε 7 γονότυπους και πολλούς υπότυπους.Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός του HCV RNA δίνουν πολύτιμες πληροφορίες τόσο για τη διάγνωση της χρόνιας λοίμωξης όσο και για την παρακολούθηση της πορείας της θεραπείας. Επιπλέον, η γνώση του γονότυπου του ιού με τον οποίο είναι μολυσμένος ο ασθενής καθορίζει τη δόση και τη διάρκεια του θεραπευτικού σχήματος και αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την παρακολούθηση και τη δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε διάφορους πληθυσμούς.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη in-house μεθόδων α) για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του HCV RNA και β) για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ιού HCV προκειμένου να μελετηθεί η πολυμορφία του HCV στην Ελλάδα.Σε ότι αφορά στη μέθοδο του ποσοτικού προσδιορισμού του HCV RNA στοχεύσαμε το 3΄άκρο του γονιδιώματος του ιού σε αντίθεση με όλες τις εμπορικά διαθέσιμες μεθόδους που βασίζονται στην ενίσχυση του 5΄άκρου. Μετά από πολλές δοκιμές με διάφορες πλατφόρμες και συνδυασμούς αντιδραστηρίων τελικά καταλήξαμε στη χρησιμοποίηση της τεχνολογίας της one step real time PCR (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου σε ένα βήμα) στην πλατφόρμα Light Cycler (Roche) και η αξιοπιστία της μεθόδου ελέγχθηκε τόσο με διεθνή standards όσο και με τη σύγκρισή της με δύο εγκεκριμένες εμπορικές μεθόδους των εταιρειών Abbott και Roche. Έτσι δημιουργήθηκε μια μέθοδος που είναι γρήγορη, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους και η οποία μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω.Σε ότι αφορά στη μέθοδο γονοτύπησης η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν ο άμεσος προσδιορισμός της αλληλουχίας με τη διαδικασία του sequencing που αποτελεί και τη μέθοδο αναφοράς. Αρχικά σχεδιάστηκαν εκκινητές (primers) από την πολύ καλά συντηρημένη περιοχή NS5B του ιού και δοκιμάστηκαν διάφορα πρωτόκολλα PCR (αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης). Ακολούθησε η διαδικασία του sequencing για τη λήψη των αλληλουχιών οι οποίες στη συνέχεια επεξεργάζονταν με μεθόδους φυλογενετικής ανάλυσης. Η μέθοδος αξιολογήθηκε με διεθνή πρότυπα και έλαβε πιστοποίηση από το ΕΣΥΔ. Με τη μέθοδο αυτή τυποποιήθηκαν τα περισσότερα δείγματα που ήταν απροσδιόριστα (με τη μέθοδο του αντίστροφου υβριδισμού (LiPA)) στο εργαστήριό μας και ήταν η μέθοδος με την οποία μελετήθηκε η δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε ΧΕΝ (χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών) στα πλαίσια του προγράμματος «Αριστοτέλης» τα δεδομένα της οποίας δημοσιεύτηκαν σε έγκυρο επιστημονικό περιοδικό.

Study of migration and distribution of bone marrow cells transplanted animals with B16 melanoma

Цель - выявление особенностей миграции и распределения сингенных клеток костного мозга (ККМ) и его субпопуляции (МСК) после их трансплантации в органах реципиента-носителя меланомы В16. Методика. В работе использовались мыши самцы и самки линии С57Вl/6. Индукция опухолевого роста: имплантировали клетки меланомы В16 подкожно в заднюю правую лапу самок мышей С57Bl/6 в дозе 2,5 х 10 клеток/мышь. Изучение миграции и распределения in vivo ККМ и МСК осуществляли при помощи генетического маркера - специфической последовательности Y-хромосомы самцов линии С57Bl/6 при сингенной внутривенной трансплантации самкам с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на Authorized Termal Cycler - Light Cycler 480 II/96 (Roche). Введение суспензии неразделенных клеток костного мозга, мезенхимальных стволовых клеток от самцов-доноров мышам-реципиентам (сингенным реципиентам самкам С57Вl/6) с последующим выделением органов реципиентов проводилось через определенные временные интервалы, затем из органов реципиентов выделяли ДНК. Результаты. Показано, что клетки костного мозга, позитивные по Y-хромосоме, мигрируют как в лимфоидные (лимфатические узлы, селезенку, костный мозг), так и в нелимфоидные органы (печень, сердце, головной мозг, кожу) сингенных реципиентов. Помимо миграции клеток из костного мозга в другие органы, существует и обратный путь миграции клеток из кровотока в костный мозг. Развитие у интактных мышей линии С57Вl/6 меланомы В16 стимулирует процессы миграции трансплантированных ККМ и МСК в костный мозг. Установлено, что при опухолевом росте усилена миграция трансплантированных клеток костного мозга, в том числе и популяции МСК, в костный мозг. На ранней стадии формирования опухоли миграционная активность МСК в опухоль выше по сравнению с неразделенной фракцией костного мозга. На поздних стадиях формирования опухоли неразделенная популяция клеток костного мозга интенсивнее мигрирует в опухоль по сравнению с популяцией МСК. Заключение. Обсуждается возможность использования МСК костного мозга для таргетной терапии опухолевых заболеваний, так как миграция МСК в опухолевую ткань может быть использована для эффективной доставки противоопухолевых препаратов. Purpose. Reveal features migration and distribution of syngeneic bone marrow cells (BMC) and subpopulations (MSC) after transplantation into the recipient carrier B16 melanoma bodies. Methods. We used mouse male and female C57BL/6 mice. Induction of Tumor Growth: B16 melanoma cells implanted subcutaneously into right hind paw of female C57BL/6 mice at a dose of 2.5 x 105 cells / mouse. migration study in vivo distribution and BMC and MSC was performed using genetic markers - Y-chromosome specific sequence line male C57Bl/6 syngeneic intravenous transplantation in females using the polymerase chain reaction (PCR) in real time on Authorized Termal Cycler - Light Cycler 480 II / 96 (Roche). Introduction suspension of unseparated bone marrow cells, mesenchymal stem cells from donor to recipient male mice (syngeneic recipient female C57BL/6), followed by isolation of recipients of organs was performed at regular intervals, then of organ recipients isolated DNA. Results. It was shown that bone marrow cells positive for Y-chromosome in migrate lymphoid (lymph nodes, spleen, bone marrow) or in non-lymphoid organs (liver, heart, brain, skin) syngeneic recipients. In addition to the migration of cells from the bone marrow to other organs, there is a way back migration of cells from the circulation to the bone marrow. B16 melanoma stimulates the migration of transplanted MSCs and BMC in bone marrow. It is found that tumor growth enhanced migration of transplanted bone marrow cells, including populations of MSCs in the bone marrow. In the early stages of tumor formation MSC migration activity higher than the BMC. In the later stages of tumor formation undivided population of bone marrow cells migrate to the intense swelling compared with a population of MSCs. Conclusion. The possibility of using bone marrow MSCs for targeted therapy of tumor diseases, because migration of MSCs in tumor tissue can be used to effectively deliver anticancer drugs.

Μελέτη και κλινική αξιολόγηση νέων μοριακών δεικτών καρκίνου του μαστού

Πρόσφατες μελέτες συμπεριλαμβάνουν το γονίδιο PALB2 (Partner and localizer ofBRCA2) στην συνεχώς αυξανόμενη λίστα των γονιδίων κληρονομούμενου καρκίνου του μαστού. Εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 16p12.1 και αποτελείται από 13 εξόνια που μεταγράφουν mRNA περίπου 3,5 Kb που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 1186 αμινοξέων. Τα εξόνια 4 και 5 είναι αισθητά μεγαλύτερα από όλα τα άλλα (65 % του γονιδίου). Οι παθογνωμικές μεταλλάξεις του προσδίδουν έναν σοβαρό κίνδυνο καρκίνου του μαστού στους ετεροζυγώτες και αναιμία Fanconi στους φορείς διαλληλικών μεταλλάξεων (γι’ αυτό αλλιώς ονομάζεται και FANCN). Οι μεταλλάξεις του είναι σπάνιες και έχουν ανιχνευθεί στο 1-2 % των BRCA αρνητικών γυναικών με καρκίνο του μαστού. Η πρωτεΐνη PALB2 αποτελεί τον συνδετικό κρίκο των BRCA2 και BRCA1 που εντοπίζονται στον πυρήνα και συμμετέχει στην επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μέσω του αλάθητου ομόλογου ανασυνδυασμού. Η σημαντική του συνεισφορά θα μπορούσε να περιοριστεί αρκετά,εκτός από την ύπαρξη μεταλλάξεων, εάν επηρεαζόταν από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως την μεθυλίωση των CpG νησίδων του υποκινητή. Σ’ αυτή την περίπτωση, οι ασθενείς θα μπορούσαν να ωφεληθούν από θεραπευτική αγωγή μεPARP αναστολείς.Σκοπός της εργασίας ήταν: Α) η πλήρη γενετική μελέτη του γονιδίου PALB2 για την εύρεση τυχόν μεταλλάξεων σε δείγματα DNA περιφερικού αίματος ασθενών με κληρονομούμενο καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών Β) η ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PALB2 σε δείγματα ιστού ασθενών με σποραδικό καρκίνο του μαστού για τον εντοπισμό τυχόν επιγενετικών μηχανισμών που να εμποδίζουν την έκφρασή του. Μέθοδοι. Για τη γενετική ανάλυση των μεγάλων εξονίων του γονιδίου (εξόνιο 4 και 5)αναπτύχθηκε νέα μεθοδολογία PTT (Protein Truncation Test) ενώ για τα υπόλοιπα μικρά εξόνια του γονιδίου εφαρμόστηκε μεθοδολογία HRMA. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σ’ όλα τα δείγματα με την μεθοδολογία DNA Sequencing που είχε αναπτυχθεί από την ομάδα μας. Επιπλέον, το γονίδιο ελέγχθηκε και για μεγάλες γενωμικές αναδιατάξεις με την μέθοδο MLPA. Για την ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PALB2, αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν μεθοδολογίες pyrosequencing για την μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου και RT-qPCR με ανιχνευτή TaqMan στο Light Cycler για την ποσοτικοποίηση τωνPALB2 mRNA μεταγράφων. Απομονώθηκε RNA από 91 καρκινικά δείγματα (και 4 φυσιολογικά) και παράχθηκε cDNA. Στην συνέχεια έγινε προσπάθεια επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων έκφρασης με PALB2 πολυκλωνικό αντίσωμα με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας (IHC).Αποτελέσματα – Συμπεράσματα γενετικής ανάλυσης PALB2 γονιδίου. Κατά τη γενετική ανάλυση 57 δειγμάτων (ανάμεσά τους 15 με μυελοειδή καρκίνο του μαστού) βρέθηκε σε δύο δείγματα η παρανοηματική μετάλλαξη Q599R, σε πέντε η συνώνυμη μετάλλαξη Τ1100Τ και σε ένα μια νέα ιντρονική μετάλλαξη. Όλες θεωρούνται πολυμορφισμοί και δεν ανιχνεύθηκε παθογνωμική μετάλλαξη. Η MLPAανάλυση απέβηκε αρνητική σ’ όλα τα δείγματα. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη καταγεγραμμένη PALB2 γενετική ανάλυση στον σπάνιο υπότυπο των μυελοειδών καρκινωμάτων μαστού.Αποτελέσματα – συμπεράσματα έκφρασης PALB2 γονιδίου. Κατά τη μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου δε βρέθηκε κανένα δείγμα που να είναι μεθυλιωμένο, συνεπώς η μεθυλίωση του DNA δεν φαίνεται να είναι ένας πιθανός μηχανισμός αποσιώπησης του γονιδίου. Κατά την ανάλυση έκφρασης με RTqPCR,4 δείγματα από τα 91 δεν εμφάνισαν έκφραση. Το γεγονός αυτό διερευνήθηκε περαιτέρω με πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Κατέδειξαν μόνο κυτταροπλασματική χρώση της PALB2 πρωτεΐνης και καθόλου πυρηνική όπως αναμενόταν γεγονός που πιθανόν οφείλεται σε ελαττωματικό αντίσωμα και συνεπώς δεν μπορούσε να εξαχθεί συμπέρασμα για τον λόγο μη έκφρασης του γονιδίου. O μέσος όρος των αντιγράφων ήταν 7,23×104copies/μg ολικού RNA, ενώ η μέση τιμή ήταν 1,34×104copies/μg(εύρος 3,51×10 to 1,23×106copies/μg). Έγινε προσπάθεια συσχέτισης των επιπέδωνPALB2 mRNA με τα κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων που αναλύθηκαν (μέγεθος όγκου, βαθμός, λεμφαδένες, μετάσταση, ορμονικούς υποδοχείς, C-ERBB2 έκφραση) ωστόσο δεν βρέθηκε κάποιος στατιστικά σημαντικός συσχετισμός. Δεν φαίνεται λοιπόν να αποτελεί η PALB2 έκφραση καλό προγνωστικό και προβλεπτικό δείκτη.

Ekspresi Gen Family Bcl-2 dan Ekspresi Gen Protein Kanal Ion Vdac1 pada Oligozoospermia

AbstrakSalah satu bentuk infertilitas pada pria adalah jumlah spermatozoa yang kurang dari normal (Oligozoospermia). Berbagai mekanisme diduga berperan dalam terjadinya oligozoospermia, mulai dari faktor fisik, stress, makanan dan molekuler. Penelitian ini merupakan kajian molekuler terhadap pengaruh ekspresi gen Bax, Bcl-2 dan VDAC terhadap terjadinya oligozoospermia. Penelitian dilakukan terhadap 40 sampel oligozoospermia dan sebagai kontrol adalah golongan normozoospermia dengan jumlah yang sama banyak. Sperma diisolasi menggunakan Percoll hypaque. Isolasi RNA menggunakan High Pure RNA isolation kit (Roche). Selanjutnya dilakukan pembuatan cDNA menggunakan First Strand cDNA synthetis (Roche). Tingkat ekspresi gen dinilai menggunakan mesin Light Cycler 2.0 (Roche). Primer didesain menggunakan software primer 3 plus dan spesifikasi primer dianalisis dengan Basic Local Alignment Search Tool (Blast). Tingkat ekspresi dibandingkan menggunakan Housekeeping gene (β-actin). Berdasarkan data penelitian diketahui tingkat ekspresi VDAC dan BAX lebih tinggi pada kelompok oligozoospermia dibanding normo (p < 0.05), namun tidak ditemukan perbedaan pada gen Bcl-2 (p > 0.05). Berdasarkan proporsi ekspresi ditemukan sebagian besar kelompok oligozoospermia mengalami overekspresi pada gen VDAC dan BAX (90% dan 93.3%), namun tidak ada overkekspresi pada normo (p>0.05). Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa overekspresi VDAC dan BAC berkaitan dengan kejadian oligozoospermiaKata kunci: Oligozoospermia, VDAC, Bax, Bcl-2, ekspresi genAbstractOne form of infertility in men is the number of spermatozoa which is less than normal (Oligozoospermia). Various mechanisms though have a role in the occurrence of oligozoospermia, it can be from physical factors, stress, food and molecular.This research is a molecular study of gen expression, Bax, Bcl2 and VDAC influence of the oligozoospermia’s occurrence.The research is conducted on 40 samples of oligozoospermia and as a control is normozoospermia class with a lot of number. The sperm are isolated with Percoll hypaque. RNA isolation use High Pure RNA isolation Kit (Roche). Next, conducted the cDNA making by using First Strand cDNA synthetis (Roche). Gene Expression level was rated by using Light Cycler 2.0 machine (Roche).The Primer are designed using software primer 3 plus and primer specification that analyzed with Basic Local Alignment Search Tool (Blast). The expression level was compared by using Housekeeping gene (β-actin).According to the research data known that VDAC and BAX expression level higher in oligozoospermia class than normozoospermia (p < 0.05), but did not find any differences in Bcl-2 gene (p > 0.05). Based on the proportion of expression was found some oligozoospermia class that encounter over expression in VDAC and BAX gene (90% and 93.3%), but there is no expression in normozoospermia (p > 0.05).This research can be concluded that the over expression of VDAC and BAX associated with the incidence of oligozoospermia.Keywords: Oligozoospermia, VDAC, BAX, Bcl2, and gene expression

138 THE EFFECT OF FOLLICLE SUPERSTIMULATION ON mRNA LEVELS IN BOVINE OOCYTES COLLECTED BY OVUM PICKUP

A previous study revealed that follicle superstimulation significantly improved the developmental competence of immature bovine oocytes collected by ovum pickup (OPU; Imai et al. 2008 Reprod. Fertil. Dev. 20, 182). The aim of the present study was to investigate the effect of follicle superstimulation on the expression of developmentally important genes in bovine oocytes collected by OPU. Follicular oocytes were collected by OPU without (OPU group) or after follicle superstimulation by FSH (FSH/OPU group) by using a 7.5-MHz linear transducer with needle connected to an ultrasound scanner according to Imai et al. (2008). In the FSH/OPU group, after dominant follicle removal from Holstein dry cows by OPU, a CIDR was inserted on Day 5 (dominant follicle removal = Day 0). Cows then received 30 mg of FSH twice a day from Days 7 to 10 in decreasing doses (6, 6, 4, 4, 3, 3, 2, 2 mg) by IM injection. Cloprostenol (PGF; Clopromate C; Sumitomo Pharmaceuticals Co., Tokyo, Japan; 0.75 mg) was administered in the morning of Day 9 (third day of superstimulation). Oocyte collection by OPU was performed 48 h after PGF administration (Day 11) by the aspiration of follicles larger than 5 mm in diameter. In the OPU group, 3-to-6-mm follicles were aspirated without any previous hormone treatment. In vitro oocyte maturation (IVM) was performed according to Imai et al. (2006 J. Reprod. Dev. 52(Suppl), 19–29). Gene expression was assessed before (0 h IVM) and after IVM (22 h IVM) by RT quantitative PCR. The following genes were investigated: GAPDH, G6PDH, ACTB, H2A, CCNB1, MnSOD, OCT4, SOX2, CX43, HSP70, GLUT8, PAP, GDF9, COX1, ATP1A1, CDH1, CTNNB1, AQP3, DYNLL1, DYNC 1/1 and PMSB1. In brief, mRNA was extracted from 20 oocytes per sample using Qiagen RNeasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Gene expression was analysed by a Roche Light Cycler 480 device. The relative expression of each gene was normalized to ACTB. Three replications were performed. Data were analysed by ANOVA. At 0 h IVM, PAP and DYNC 1/1 were found to be down-regulated (P < 0.05) in the FSH/OPU group compared with the OPU group, whereas the rest of the studied genes showed similar expression in the FSH/OPU and OPU groups. At 22 h IVM, PAP and DYNC 1/1 remained down-regulated in FSH/OPU oocytes. However, at this time the expression of GDF9 appeared significantly higher (P < 0.05) in FSH/OPU oocytes than in OPU oocytes. The expression of GDF9 was found to decrease during IVM in both groups; however, this decrease was less drastic in FSH/OPU oocytes. The results suggest that follicle superstimulation caused reduced expression of mRNA levels of PAP and DYNC 1/1 irrespective of maturation status and it also moderated the reduction of mRNA levels of GDF9 during IVM.