Improvement of the Catalytic Ability of a Thermostable and Acidophilic β-Mannanase Using a Consensus Sequence Design Strategy

In order to improve the catalytic efficiency of a thermostable and acidophilic β-mannanase (ManAK; derived from marine Aspergillus kawachii IFO 4308), three mutants were designed by amino acid sequence consensus analysis with a second β-mannanase (ManCbs), which also belongs to the glycoside hydrolase family 5 (GH5) and has excellent catalytic efficiency. Three mutants were constructed and their biochemical characteristics were measured after heterologous expression in Pichia pastoris. The results revealed that the kcat/Km values of the three recombinant mannanases ManAKC292V, ManAKL293V, and ManAKL294H were enhanced by 303.0, 280.4, and 210.1%, respectively. Furthermore, ManAKL293V showed greater thermostability than ManAK, retaining 36.5% of the initial enzyme activity after incubation at 80°C for 5min. This study therefore provides a rational design strategy based on consensus sequence analysis to develop industrially valuable β-mannanase for future applications in marine aquafeed.

Inulinasa de Aspergillus kawachii IFO 4308: caracterización, clonado, sobreexpresión, y aplicación en procesos biotecnológicos

El presente trabajo de tesis doctoral describe la caracterización, clonado, sobreexpresión, y aplicación en procesos biotecnológicos de una inulinasa de Aspergillus kawachii IFO 4308. Las inulinasas son enzimas que actúan sobre los enlaces β-(2→1) fructano en la inulina presentes en muchos vegetales. Es por ello, que el aprovechamiento de la actividad catalítica de estas enzimas es de gran interés en numerosas aplicaciones biotecnológicas como la producción de fructosa, de fructooligosacáridos, bioetanol, 2,3-butanodiol, ácido láctico, jarabe de sorbitol, ácido glucónico, manitol, entre otros. Los microorganismos son las mejores fuentes para la producción de inulinasas debido a su fácil cultivo y alta producción de enzima, en comparación con los vegetales. El género Aspergillus ha sido reportado como uno de los mayores productores de inulinasa. En general, estos microorganismos que producen enzimas de interés industrial lo hacen en niveles muy bajos, por lo tanto, se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de operación, pero esto está limitado por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el organismo. Otra posibilidad es la producción de la enzima en sistemas recombinantes para lograr la obtención de altas cantidades requeridas en la industria. El sistema de expresión de Pichia pastoris ha mostrado gran eficiencia en la producción de enzimas y fue el utilizado en este trabajo de tesis. La presencia de inulina en los tubérculos de yacón despertó el interés por utilizar esta raíz andina, cultivada en el norte argentino, como sustrato para la producción de la enzima, como alternativa a las materias primas comerciales actuales y en el horizonte de revalorar la producción regional de este producto. Se comenzó con el estudio de la producción de inulinasa utilizando la cepa Aspergillus kawachii IFO 4308. Para aumentar la producción de la enzima se estudió el efecto de diferentes fuentes de carbono y energía individualmente o en combinación con yacón, fuentes de nitrógeno, así como los parámetros del proceso: concentración de inóculo, temperatura y pH inicial. Se utilizó una estrategia de optimización del medio de cultivo de una variable a la vez, así se logró duplicar la actividad enzimática, que alcanzó un valor de 92,3±0,5 mU/ml a las 72 h de cultivo (productividad = 1,28 U/l/h). En escala de biorreactor la actividad inulinasa fue de 124,1 ±2,1 mU/ml a las 48 h de cultivo (productividad= 2,58 U/l/h), en las mismas condiciones, lo que significó un incremento de 1,3 veces con respecto al cultivo en matraz Erlenmeyer. La inulinasa producida por Aspergillus kawachii IFO 4308 presentó pH óptimo de 3 y resultó ser estable a una temperatura de 65 °C por 180 minutos, donde retuvo el 20 % de la actividad residual. Estas características plantearon la posibilidad de estudiar su aplicación en procesos industriales, sin embargo, la baja productividad del proceso completo llevó a considerar una estrategia de clonado y la sobreexpresión para hacer este proceso más adecuado para sus potenciales demandas y aplicaciones industriales. Se llevaron adelante tres estrategias de clonado, una a partir de ARN y dos a partir de ADN, una utilizando el gen inulinasa con intrón en pPIC9 y la otra utilizando el gen inulinasa sin intrón, eliminado in vitro, en pPICZαA. Con esta última estrategia se logró expresar la inulinasa genéticamente modificada que se produjo con éxito en fermentaciones en biorreactor, alcanzando 622,4 U/ml y una productividad de 25933,3 U/l/h después de 69 h un cultivo. Resultó funcional con niveles de producción de actividad enzimática 5000 veces más a los reportados por el organismo silvestre. La enzima recombinante resultó una exoinulinasa con actividad fructosiltransferasa y presentó las mismas propiedades bioquímicas que la enzima nativa. Con la finalidad de mejorar tanto las propiedades de la enzima, como la productividad del proceso, se estudió la inmovilización covalente de la inulinasa recombinante en esferas de quitosan optimizando la concentración de un agente entrecruzante, glutaraldehído, y el tiempo de activación de las esferas mediante un diseño factorial. Se consiguió aumentar la estabilidad operacional de la enzima que retuvo 40 % actividad residual a 65 °C durante 180 minutos, lo que posibilita una ventaja adicional en su campo de acción. El enlace formado entre la inulinasa recombinante y el quitosán resultó ser lo suficientemente estable para evitar desprendimientos de la enzima y con ello mantener la eficiencia catalítica del sistema durante 12 ciclos de uso. Finalmente, se estudiaron las condiciones de aplicación, la producción de FOS partir de sacarosa y la hidrólisis de fructano de agave a partir de subproductos de la industria. Se obtuvieron altos rendimientos de hidrólisis en jugos de agave. La combinación de estrategias adecuadas de ingeniería genética, los estudios de producción en escala de biorreactor, los procesos de purificación y los ensayos de inmovilización junto con las características bioquímicas que presentó la enzima, permitieron generar cantidades suficientes de una enzima de aplicación industrial. Estos estudios son la base para un futuro desarrollo de procesos tecnológicos respecto a la obtención de fructooligosacáridos y jarabe de fructosa utilizando una tecnología amigable con el ambiente. Posteriores estudios de optimización, producción a mayor escala y estimación de los costos del proceso completo serán necesarios para la implementación de estos procesos en la industria.

Transformation of Major Ginsenosides into Minor Ginsenosides in Ginseng by Pickling in Salted Rice Malt Paste

Increasing the content of minor ginsenosides in ginseng enhances its pharmaceutical activities. For this study, minor ginsenosides F2 and CK were produced in ginseng by pickling in a salted rice malt paste fermented using Aspergillus kawachii. The A. kawachii excluded β-glucosidase in the culture broth with 125 mU/mL after 16 d cultivation, and hydrolyzed major ginsenoside Rb1 to generate F2 and CK on the pathway Rb1→Rd→F2→CK. Steamed rice was fermented by A. kawachii with 14% NaCl to produce a salted rice malt paste as a pickle bed with 165 mU/mL of β-glucosidase. Fresh 1-year-old and 6-year-old ginseng, which had Rb1 and Rd but which had neither F2 nor CK, were pickled in the salted rice malt paste for 28d. The extract showed production of F2 and CK, and changed the ratio of Rb1, Rd2, F2, and CK in ginseng.

Enhanced anti-oxidative effect of fermented Korean mistletoe is originated from an increase in the contents of caffeic acid and lyoniresinol

The crude enzyme extract derived from Aspergillus kawachii increased the anti-oxidants, caffeic acid and lyoniresinol, in Korean mistletoe.