Έκφραση του c - mos στον καρκίνο του πνεύμονα. Πρότυπα έκφρασης c - mos / p53 σε σχέση με τις κινητικές παραμέτρους

Το πρωτο-ογκογονίδιο c-mos είναι το κυτταρικό ανάλογο του ν-mos ογκογονιδίου, προϊόντος του ιού MMSV (Moloney murine sarcoma virus) που ταυτοποιήθηκε στις αρχές της δεκαετίας του ’80. Εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 8q11-12 και κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη 39 kDa με δραστικότητα κινάσης σερίνης-θρεονίνης. Το c-mos ενεργοποιεί την οδό των ΜΑΡΚ, φωσφορυλιώνοντας την κινάση των ΜΑΡΚ (ΜΑΡΚΚ). Παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των ωοκυττάρων, κατά την οποία, ως συστατικό του κυτταροστατικού παράγοντα (cytostatic factor, CSF), αναστέλλει την πρόοδο των ωοκυττάρων στη μετάφαση II σταθεροποιώντας τον παράγοντα προαγωγής της ωρίμανσης (Maturation Promoting Factor, MPF). Επιπλέον, η δραστικότητα του c-mos συνδέεται με τον κατάλληλο σχηματισμό και προσανατολισμό της μειωτικής ατράκτου και στην επακόλουθη ασύμμετρη διαίρεση του ωοκυττάρου και την παραγωγή του πρώτου πολικού σωματίου. Παρόλο που ο ρόλος του c-mos στην ωρίμανση των ωοκυττάρων είναι γνωστός, πολύ λίγα είναι γνωστά για την έκφρασή του και τις λειτουργίες του στα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα. Συνεχής (constitutive) έκφραση του c-mos σε σωματικά κύτταρα, όπως σε ινοβλάστες ποντικιού, επάγει τον καρκινικό μετασχηματισμό. Υπάρχουν ισχυρά στοιχεία ότι η μετασχηματιστική δράση του c- mos, όπως πολλών άλλων προϊόντων ογκογονιδίων, ασκείται όταν εκφράζεται στην G1 φάση. Βασιζόμενη στη μελέτη των Fukasawa και Vande Woude, η οποία ανέφερε ότι η υπερέκφραση του mos μέσω του MAPK/ERK μονοπατιού προκαλεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση, η οποία είναι p53-εξαρτώμενη, η παρούσα μελέτη προσπάθησε να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ έκφρασης του mos και της p53. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Saos με το επαγόμενο σύστημα τετρακυκλίνη. Στο συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα, στο οποίο το γονίδιο p53 έχει ομόζυγα απαλειφθεί, η αποκατάσταση της έκφρασης της p53, με την προσθήκη τετρακυκλίνης, αυξάνει δραματικά τα επίπεδα κυτταρικού θανάτου. Παρόλα αυτά, η εισαγωγή του ογκογονιδίου c-mos και η απότοκος έκφραση του αντίστοιχου προϊόντος επέδειξε σημαντική μείωση στα επίπεδα του κυτταρικού θανάτου συγκριτικά με τα συστήματα αναφοράς, ανεξαρτήτως της έκφρασης ή μη της p53. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει, ότι με κάποιο μηχανισμό η ύπαρξη του mos έχει τη δυνατότητα να καταστέλλει την απόπτωση, ασχέτως αν τα επίπεδα αλλοιώσεων του DNA είναι υψηλά και ανεξαρτήτως του αν οι αντίστοιχοι μηχανισμοί επιτήρησης και προστασίας του γενώματος είναι ενεργοί. Εφόσον η πατρική κυτταρική σειρά Saos αποτελεί σύστημα υψηλού επιπέδου ενδογενών αλλοιώσεων του DNA και κυριότερα του τύπου των δικλωνικών θραύσεων, θεωρήθηκε σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί η κυτταρική σειρά U20S, που φέρει χαμηλά επίπεδα ενδογενών αλλοιώσεων DNA. Το συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα φέρει ακέραιη p53. Στις δυο νέες κυτταρικές σειρές που προέκυψαν, στην U2OS-mos και στην U2OS-mock αρχικά ασκήθηκε γενοτοξική προσβολή με την εφαρμογή ιοντίζουσας ακτινοβολίας σε ένταση 3, 6 και 9 Gy και ακολούθως εκτιμήθηκαν τα επίπεδα απόπτωσης. Παρατηρήθηκε, ότι η έκφραση mos σχετιζόταν χαρακτηριστικά με σημαντικά μειωμένη απόπτωση. Υποτέθηκε, πως τα U20S κύτταρα, εφόσον φέρουν ακέραιη p53 πρωτεΐνη, θα εκδήλωναν μετέπειτα ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου G1 και αναστολή του κυτταρικού κύκλου μετά τη γενοτοξική επίδραση της ταξόλης ή νοκοδαζόλης, με αποτέλεσμα να οδηγηθούν στην απόκτηση φαινοτύπου γήρανσης. Πράγματι, δέκα μέρες μετά την έξοδο από τη μίτωση τα επιβιώσαντα mos-θετικά κύτταρα είχαν στην συντριπτική τους πλειοψηφία αποκτήσει αξιοσημείωτα μεγάλο μέγεθος, σχήμα αποπλατυσμένο και εκδήλωναν ισχυρά θετική αντίδραση β-γαλακτοσιδάσης σε pH 6, που θεωρείται βιβλιογραφικά ως παθογνωμονικός δείκτης κυτταρικής γήρανσης. Προκειμένου να διερευνηθεί περισσότερο η δράση του mos στα ανθρώπινα κύτταρα, η μελέτη επεκτάθηκε σε κυτταρικά συστήματα ανθρώπινων πρωτογενών ινοβλαστών (IMR90 και MRC5), στους οποίους το mos εισήχθη με διαμόλυνση μέσω ρετροϊών. Αξιοσημείωτο ήταν το γεγονός, ότι τα κύτταρα, που δέχτηκαν το mos, συχνά αποκτούσαν φαινότυπο γιγαντιαίου κυττάρου ενώ σε σημαντικό ποσοστό διέφεραν από τα κύτταρα ελέγχου στο γεγονός ότι εκδήλωναν μεγαλύτερα ποσοστά κυτταρικού θανάτου και παράλληλα όσα ζούσαν εκδήλωναν θετικότητα για τη χρώση β-γαλακτοσιδάσης, που καταδεικνύει κυτταρική γήρανση. Συνεπώς η είσοδος του mos σε ακέραια φυσιολογικά κυτταρικά συστήματα είναι ικανή να πυροδοτήσει τους δυο κυρίαρχους αντικαρκινικούς μηχανισμούς, την απόπτωση και την κυτταρική γήρανση.

Functional Characterization of the Dimer Linkage Structure RNA of Moloney Murine Sarcoma Virus

ABSTRACT Several determinants that appear to promote the dimerization of murine retroviral genomic RNA have been identified. The interaction between these determinants has not been extensively examined. Previously, we proposed that dimerization of the Moloney murine sarcoma virus genomic RNAs relies upon the concentration-dependent interactions of a conserved palindrome that is initiated by separate G-rich stretches (H. Ly, D. P. Nierlich, J. C. Olsen, and A. H. Kaplan, J. Virol. 73:7255–7261, 1999). The cooperative action of these two elements was examined using a combination of genetic and antisense approaches. Dimerization of RNA molecules carrying both the palindrome and G-rich sequences was completely inhibited by an oligonucleotide complementary to the palindrome; molecules lacking the palindrome could not dimerize in the presence of oligomers that hybridize to two G-rich sequences. The results of spontaneous dimerization experiments also demonstrated that RNA molecules lacking either of the two stretches of guanines dimerized much more slowly than the full-length molecule which includes the dimer linkage structure (DLS). However, the addition of an oligonucleotide complementary to the remaining stretch of guanines restored the kinetics of dimerization to wild-type levels. The ability of this oligomer to rescue the kinetics of dimerization was dependent on the presence of the palindrome, suggesting that interactions within the G-rich regions produce changes in the palindrome that allow dimerization to proceed with maximum efficiency. Further, unsuccessful attempts to produce heterodimers between constructs lacking various combinations of these elements indicate that the G-rich regions and the palindrome do not interact directly. Finally, we demonstrate that both of these elements are important in maintaining efficient viral replication. Modified antisense oligonucleotides targeting the DLS were found to reduce the level of viral vector titer production. The reduction in viral titer is due to a decrease in the efficiency of viral genomic RNA encapsidation. Overall, our data support a dynamic model of retroviral RNA dimerization in which discrete dimerization elements act in a concerted fashion.

Moloney Murine Sarcoma Virus Genomic RNAs Dimerize via a Two-Step Process: a Concentration-Dependent Kissing-Loop Interaction Is Driven by Initial Contact between Consecutive Guanines

ABSTRACT Retroviruses contain two plus-strand genomic RNAs, which are stably but noncovalently joined in their 5′ regions by a dimer linkage structure (DLS). Two models have been put forward to explain the mechanisms by which the RNAs dimerize; each model emphasizes the role of specific molecular determinants. The kissing-loop model implicates interactions between palindromic sequences in the DLS region. The second model proposes that purine-rich stretches in the region form purine quartet structures. Here, we present an examination of the in vitro dimerization of Moloney murine sarcoma virus (MuSV) RNA in the context of these two models. Dimers were found to form spontaneously in a temperature-, time-, concentration-, and salt-dependent manner. In contrast to earlier reports, we found that deletion of neither the palindrome nor the consensus purine motifs (PuGGAPuA) affected the level of dimer formation at low concentrations of RNA. Rather, different purine-rich sequences, i.e., consecutive stretches of guanines, were found to enhance both in vitro RNA dimerization and in vivo viral replication. Biochemical evidence further suggests that these guanine-rich (G-rich) stretches form guanine quartet structures. We also found that the palindromic sequences could support dimerization at significantly higher RNA concentrations. In addition, the G-rich stretches were as important as the palindromic sequence for maintaining efficient viral replication. Overall, our data support a model that entails contributions from both of the previously proposed mechanisms of retroviral RNA dimerization.