Μελέτη επί της παρουσίας των Culicidae στην Ελλάδα, της μοριακής ταξινόμησης αυτών και της εποχικής διακύμανσης και του κρατούντος συστήματος αντιμετώπισής τους στους ορυζώνες
Οι πρώτες προσπάθειες για την καταγραφή των κουνουπιών που ενδημούν στη χώρα μας ξεκίνησαν από Έλληνες και ξένους ερευνητές στις αρχές του 20ου αιώνα, αμέσως μετά την ανακάλυψη του ρόλου των ειδών του γένους Anopheles στη μετάδοση της ελονοσίας. Ο τελευταίος κατάλογος των ειδών κουνουπιών που διαβιούν στην Ελλάδα συντάχθηκε το 2011 και περιλαμβάνει 64 είδη ταξινομημένα σε 2 υποοικογένειες και 8 γένη. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η επικαιροποίηση της καταγραφή της εξάπλωσης των ειδών των κουνουπιών στην Ελλάδα. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν τυχαίες δειγματοληψίες για τη συλλογή κουνουπιών από τον Απρίλιο του 2009 έως και τον Αύγουστο του 2012 σε 25 συνολικά Περιφερειακές Ενότητες ενώ έγινε προσπάθεια να καλυφθεί όσο το δυνατό μεγαλύτερο εύρος εστιών ανάπτυξης των κουνουπιών (δέλτα ποταμών, λίμνες, ρέματα, πηγάδια, αστικά περιβάλλοντα, μόνιμες και μη συλλογές νερού). Κατά τη διάρκεια της μελέτης συλλέχθηκαν περισσότερα από 5.200 δείγματα (άτομα) προνυμφών, νυμφών και τελείων κουνουπιών. Από το σύνολο των ατόμων που εξετάστηκαν, αναγνωρίσθηκαν 24 είδη κουνουπιών, από 6 διαφορετικά γένη (Anopheles, Culex, Aedes, Ochlerotatus, Culiseta και Uranotaenia). Το είδος Culex pipiens εντοπίστηκε σε όλες σχεδόν τις εστίες από τις οποίες λήφθηκε δείγμα. Επίσης, τα περισσότερα από τα ευρεθέντα είδη είναι σημαντικά από υγειονομική άποψη καθώς μπορούν να αποτελέσουν φορείς σοβαρών ασθενειών που προσβάλλουν τον άνθρωπο. Λόγω των προβλημάτων που αρκετές φορές παρουσιάζονται με τη χρησιμοποίηση των μορφομετρικών χαρακτήρων για την ταξινόμηση των οργανισμών χρησιμοποιούνται πλέον και τεχνικές που αφορούν το γενετικό υλικό. Αυτές συνήθως στοχεύουν στην ανάλυση του γενετικού υλικού, αλλά πολλές φορές και σε παράγωγά του, όπως είναι οι πρωτεΐνες και τα ένζυμα. Στην παρούσα εργασία έγινε μοριακή ανάλυση τριών ειδών κουνουπιών με στόχο την συμβολή της μελέτης στη μοριακή ταξινόμηση ειδών Culicidae στην Ελλάδα. Τα είδη που ταξινομήθηκαν με μοριακές τεχνικές ήταν τα Culex tritaeniorhynchus, Culex laticinctus και Ochlerotatus zammitti. Τα άτομα του είδους Cx. tritaeniorhynchus συλλέχθηκαν από την Π.Ε. Αιτωλοακαρνανίας, το είδος Oc. zammitti από την Π.Ε. Ανατολικής Αττικής και το είδος Cx. laticinctus από την Π.Ε. Χανίων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν επίσης η μελέτη της σύνθεσης των ειδών κουνουπιών και η εποχική διακύμανση αυτών κατά τα έτη 2009, 2010 και 2011 σε ορυζώνα βιολογικής καλλιέργειας στην περιοχή Νεοχωρίου της Π. Ε. Αιτωλοακαρνανίας. Συλλέχθηκαν συνολικά 11.716 προνύμφες και νύμφες κουνουπιών που ανήκαν σε 4 γένη και 7 είδη (Ochlerotatus caspius, Anopheles hyrcanus, Anopheles sacharovi, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex pipiens, Uranotaenia unguiculata). Το είδος Cx. tritaeniorhynchus που ήταν το πολυπληθέστερο καταγράφηκε για δεύτερη φορά στην Ελλάδα αλλά είναι η πρώτη φορά που καταγράφηκαν υψηλές πληθυσμιακές πυκνότητες του είδους αυτού στη χώρα μας. Κατά τη διάρκεια και των 3 ετών της μελέτης η πληθυσμιακή πυκνότητα των ατελών των κουνουπιών ήταν υψηλότερη τον Αύγουστο. Ο αριθμός των ατελών όλων των ειδών ήταν υψηλότερος το 2009 και το 2010 σε σχέση με το 2011 καθώς και των τελείων του είδους Cx. tritaeniorhynchus που προέκυψαν μετά την εκτροφή των ατελών σταδίων που συλλέχθηκαν. Αυτό πιθανώς οφείλεται στην έλλειψη νερού που σημειώθηκε στον αγρό στις αρχές Αυγούστου του 2011. Το είδος Cx. tritaeniorhynchus ήταν το είδος με τη μεγαλύτερη αφθονία μετά την εκτροφή των ατελών, αποτελώντας το 85,1%, 93,5% και 96,1% του συνολικού αριθμού των τελείων κουνουπιών για το 2009, το 2010 και το 2011, αντίστοιχα. Οι καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρμόζονται στους ορυζώνες πιθανότατα επηρέασαν την εποχική εμφάνιση των ατελών των κουνουπιών και τα 3 έτη της μελέτης. Επίσης, στην παρούσα διατριβή έγινε μια καταγραφή του συστήματος και των μεθόδων αντιμετώπισης των κουνουπιών στους ορυζώνες στη χώρα μας. Για να συλλεγούν τα απαραίτητα στοιχεία συντάχθηκαν ερωτηματολόγια και απεστάλησαν σε όλους τους εμπλεκόμενους φορείς (σε εταιρείες που αναλαμβάνουν έργα αντιμετώπισης κουνουπιών σε ορυζώνες της χώρας, στις Διευθύνσεις Αγροτικής Ανάπτυξης και Κτηνιατρικής, στα διοικητικά όρια των οποίων καλλιεργείται ρύζι, στο Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων και σε ορυζόμυλους. Από τις απαντήσεις που δόθηκαν καθώς και από άλλες πηγές καταγράφηκαν τα προβλήματα του συστήματος ενώ στην μελέτη παρατίθενται και προτάσεις για τη βελτίωσή του, τόσο σε οργανωτικό όσο και σε επιχειρησιακό επίπεδο. Τέλος εξετάστηκαν τρία εντομοκτόνα σκευάσματα με δραστικές ουσίες το spinosad, το diflubenzuron και το methoprene σε σχέση με την τοξικότητά τους σε προνύμφες 3ου–4ου σταδίου του Aedes albopictus σε εργαστηριακές συνθήκες. Οι προνύμφες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα προέρχονταν από εργαστηριακή εκτροφή η οποία προήλθε από άτομα του Aedes albopictus τα οποία συλλέχθηκαν στην περιοχή της Αιτωλοακαρνανία. Τα εντομοκτόνα εξετάστηκαν στις συνιστώμενες δόσεις σύμφωνά με την ετικέτα τους (0.0984ppm, 0.1014ppm και 0.0234ppm αντίστοιχα) καθώς και στο 1/4, 1/16 και 1/64 αυτών. Οι τιμές των LC50 και LC90 του spinosad μετά από 24 ώρες έκθεσης των προνυμφών ήταν 0.0131ppm και 0.0341ppm αντίστοιχα ενώ μετά από 48 ώρες οι αντίστοιχες τιμές ήταν 0.0106ppm και 0.0239ppm. Οι τιμές των EI50 και EI90 του diflubenzuron ήταν 0.0002ppm και 0.0031ppm αντίστοιχα ενώ για το methoprene οι αντίστοιχες τιμές βρέθηκαν να είναι 0.0010ppm και 0.0104ppm. Η τοξική δράση του spinosad στην συνιστώμενη δόση και στο 1/4 αυτής ήταν ιδιαίτερα ταχεία προκαλώντας πολύ υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες μετά από 24 ώρες έκθεσης (97.5% και 88.3% θνησιμότητες αντίστοιχα). Οι τιμές LT50 κυμάνθηκαν ανάλογα με την δόση του εντομοκτόνου από 48 έως 63 ώρες για το diflubenzuron και από 64 έως 321 ώρες για το methoprene. Όλα τα σκευάσματα που εξετάσθηκαν στις συνιστώμενες δόσεις επέδειξαν υψηλή τοξικότητα στις προνύμφες του Aedes albopictus. Επτά ημέρες μετά την εφαρμογή τους οι θνησιμότητες που παρατηρήθηκαν από την δράση του spinosad, του diflubenzuron και του methoprene ήταν 99.6%, 99.2% και 97.9% αντίστοιχα. Στο 1/4 της συνιστώμενης δόσης το spinosad και το diflubenzuron παρέμειναν πολύ τοξικά και η τοξικότητές τους ήταν υψηλότερες από αυτή του methoprene. Επτά ημέρες μετά την εφαρμογή των εντομοκτόνων στο 1/16 και στο 1/64 της συνιστώμενης δόσης μόνο το diflubenzuron επέδειξε υψηλές τοξικότητες (97.1% και 81.7% θνησιμότητες αντίστοιχα) και ήταν υψηλότερες από αυτές που εμφάνισαν τα δύο άλλα σκευάσματα.