Το Viscum album είναι ένα παρασιτικό φυτό γνωστό από την αρχαιότητα γιατις θεραπευτικές του ιδιότητες. Το 1917 χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στηθεραπεία του καρκίνου και έκτοτε αρκετές μελέτες έχουν γίνει για την αντικαρκινικήδράση του εκχυλίσματος του αλλά και των πρωτεϊνών του (λεκτίνες καιβισκοτοξίνες), η οποία επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως οι εποχικέςδιακυμάνσεις. Πολλές μελέτες αναφέρουν ότι η αντικαρκινική δράση του φυτού δενβασίζεται εξ ολοκλήρου στην ύπαρξη των λεκτινών και των βισκοτοξινών, αλλάυπάρχουν και άλλα μόρια, χαμηλού μοριακού βάρους, τα οποία δρουν επίσηςκυτταροτοξικά. Παρόλα αυτά, ελάχιστες έρευνες έχουν γίνει για τα συστατικάχαμηλού μοριακού βάρους του φυτού.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή απομονώθηκαν τα λιπιδιακά κλάσματατου φυτού Viscum album ssp. abietis κατά τη διάρκεια δύο διαφορετικών εποχώνσυγκομιδής, της χειμερινής (Δεκέμβριος-Ιανουάριος) και της καλοκαιρινής (Ιούνιος-Ιούλιος) περιόδου σύμφωνα με τις μεθόδους Bligh-Dyer και Galanos-Kapoulas καικατόπιν μελετήθηκε η κυτταροτοξική τους δράση στις κυτταρικές σειρές MCF-7 καιMRC-5 με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Το κλάσμα που εμφάνισε την ισχυρότερηκυτταροτοξική δράση κατά τη διάρκεια και των δύο εποχών, αναλύθηκε περαιτέρωμε χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Κατόπιν πραγματοποιήθηκε ποσοτικόςπροσδιορισμός των λιπιδιακών συστατικών που απομονώθηκαν μέσω οξείδωσης μεδιχρωμικό άλας και έπειτα μελετήθηκε η κυτταροτοξική δράση τους στις κυτταρικέςσειρές MCF-7 και MRC-5 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΜΤΤ. Ο έλεγχος τουμηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που προκαλεί το λιπιδιακό συστατικό με τηνισχυρότερη κυτταροτοξική δράση στα καρκινικά κύτταρα και την ασθενέστερηδράση στα φυσιολογικά κύτταρα μελετήθηκε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησηςDNA σε πήκτωμα αγαρόζης. Έπειτα αυτό το λιπιδιακό συστατικό ταυτοποιήθηκε μετη μέθοδο της Υψηλής Ανάλυσης Υγρής Χρωματογραφίας Ανάστροφης Φάσης (RP-HPLC) και την τεχνική της Φασματοσκοπίας Μάζας μέσω ιονισμού μεηλεκτροψεκασμό (ESI-MS).Η δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη αντικαρκινική δράση της δομικάανάλογης ουσίας του συστατικού αυτού μελετήθηκε περαιτέρω στις κυτταρικέςσειρές LMS, MCF-7, U2OS, HeLa και MRC-5 με τις μεθόδους ΜΤΤ και Trypanblue. Επίσης μελετήθηκε η ικανότητα ανάπτυξης αποικιών των νεοπλασματικώνκυττάρων LMS και MCF-7 έπειτα από επώαση τους με αυξανόμενες συγκεντρώσειςτου συστατικού αυτού. Ο μηχανισμός θανάτου που προκαλεί η ουσία στα κύτταραμελετήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης DNA σε πήκτωμα αγαρόζης στιςκυτταρικές σειρές LMS, MCF-7 και MRC-5, καθώς επίσης και μέσω κυτταρομετρίαςροής χρησιμοποιώντας την καρκινική κυτταρική σειρά MCF-7. Επιπλέον ελέγχτηκε ηανασταλτική δράση της ουσίας αυτής στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων τουανθρώπου ex vivo. Ακολούθησε έλεγχος της τοξικής δράσης του λιπιδιακούσυστατικού σε επίμυες Wistar μέσω των μοντέλων οξείας και χρόνιας τοξικότηταςκαι έπειτα μελετήθηκε η αντικαρκινική δράση του σε καρκινοπαθείς επίμυες Wistarέπειτα από πρόκληση κακοήθους νεοπλασίας μέσω ενοφθαλμισμούλειομυοσαρκωματικών κυττάρων LMS.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το λιπιδιακό κλάσμα του φυτού με τηνισχυρότερη κυτταροτοξική δράση είναι το αιθερικό κλάσμα, το οποίο περιέχει όλα ταουδέτερα λιπίδια του φυτού (τερπένια, υδρογονάνθρακες, στερόλες). Ηχρωματογραφία λεπτής στιβάδας αποκάλυψε την ύπαρξη 6 κοινών λιπιδιακώνσυστατικών κατά την καλοκαιρινή και χειμερινή εποχή συγκομιδής και 2 επιπλέονλιπιδιακών συστατικών κατά την χειμερινή εποχή συγκομιδής. Οι συγκεντρώσεις τωνλιπιδιακών συστατικών που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια και των 2 εποχώνσυγκομιδής παρατηρείται ότι διαφέρουν και εμφανίζονται αυξημένες κατά τηδιάρκεια του χειμώνα. Επίσης η κυτταροτοξική δράση των λιπιδιακών συστατικώνείναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια της χειμερινής περιόδου. Το λιπιδιακό συστατικόμε την ισχυρότερη κυτταροτοξική δράση στα καρκινικά κύτταρα και τηνασθενέστερη δράση στα φυσιολογικά κύτταρα απομονώθηκε κατά τη διάρκεια τηςχειμερινής εποχής συγκομιδής. Η ταυτοποίηση του συστατικού αυτού έδειξε ότιπρόκειται για ένα διτερπένιο, δομικά ανάλογο της σκλαρεόλης Η σκλαρεόλη προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω του μηχανισμού τηςαπόπτωσης με δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο και οι βλάβες πουπροκαλεί στα καρκινικά κύτταρα είναι μη αναστρέψιμες. Επίσης η σκλαρεόληπροκαλεί αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων η οποία αυξάνεται σεαυξανόμενες συγκεντρώσεις της ex vivo.Οι in vivo μελέτες έδειξαν ότι η σκλαρεόλη δεν προκαλεί θάνατο σε επίμυεςWistar, ακόμα και σε πολύ μεγάλες συγκεντρώσεις (LD50>5g/kg). Η άμεση χορήγησημεγάλων συγκεντρώσεων της προκαλεί πνευμονικό οίδημα, αντιθέτως η σταδιακήχορήγηση της σκλαρεόλης, ακόμα και πολύ μεγάλων συγκεντρώσεων, δεν προκαλείβλάβη στα όργανα των πειραματόζωων. Οι παρενέργειες που προκαλεί σταπειραματόζωα έπειτα από χορήγηση μεγάλων συγκεντρώσεων της είναι δυσκινησία,καταστολή και δυσκολία στην αναπνοή, τα οποία επανέρχονται έπειτα από 24 ώρεςστη φυσιολογική τους κατάσταση. Επιπλέον μειώνει το μέγεθος του όγκουκαρκινοπαθών επίμυων Wistar κατά ένα μικρό ποσοστό (16%) ενώ αυξάνει τον χρόνοεπιβίωσης τους κατά 35% σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, αποδεικνύεται ότι το χαμηλού μοριακούβάρους διτερπένιο που απομονώθηκε από το φυτό, εμφανίζει αντικαρκινική δράση ηοποία εξαρτάται από την εποχή συγκομιδής του φυτού. Επίσης η σκλαρεόλη, ηδομικά ανάλογη ουσία του συστατικού αυτού, φέρει ισχυρή κυτταροτοξική δράση invitro. Λόγω της χαμηλής τοξικότητας που εμφανίζει και τον ήπιων παρενεργειών πουπροκαλεί in vivo, αποτελεί ένα συστατικό ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, το οποίομελλοντικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας νέος αντινεοπλασματικόςπαράγοντας.
Development and comparison of UPLC-ESI-MS and RP-HPLC-VWD methods for determining microcystin-LR