Caracterización mutacional y funcional de las proteínas de movimiento de ophiovirus

Las plagas de los cultivos son una gran amenaza para la producción agrícola, en particular, las enfermedades virales son responsables de importantes pérdidas económicas en la producción de cultivos de importancia mundial. Los ophiovirus son virus de plantas causantes de importantes enfermedades en cultivos de cítricos, lechuga, arándanos y plantas ornamentales. La psorosis de los cítricos es una enfermedad viral causada por el ophiovirus Citrus psorosis virus (CPsV), que produce un deterioro progresivo de los árboles al afectar sus tejidos conductores. Hasta el momento, no se conocen cultivares resistentes a CPsV. La enfermedad se ha reportado en muchas regiones productoras de cítricos a lo largo de todo el mundo. En nuestro país, se disemina de manera natural, reduciendo la producción de cítricos. La situación de la citricultura en todos los países de nuestra región se encuentra en expansión y constituye una actividad de muy alta importancia económica en la mayoría de éstos, con especial impacto en sus economías. El Big-vein de lechuga es otra enfermedad importante causada por ophiovirus que afecta a las principales áreas de producción de lechuga en nuestra región. El agente etiológico es el ophiovirus Mirafiori lettuce big vein virus (MiLBVV), el cual es transmitido por zoosporas móviles del hongo Olpidium virulentus. El big-vein causa serios problemas en los cultivos de lechuga durante los períodos más fríos del año y afecta a todos los tipos de lechuga que crecen en suelo al aire libre o bajo cubierta, y a los cultivos hidropónicos. La importancia económica de la enfermedad se debe a los síntoma del follaje, que reducen el valor de mercado, y a los retrasos en la formación de la cabeza y la disminución del tamaño de la planta, que reduce la proporción de plantas cosechables, ya que estas plantas suelen ser descartadas en el momento de la cosecha. Los cultivos de arándanos y variedades ornamentales como tulipán, fresia y ranúnculo también se encuentran afectados por ophiovirus. Debido a las pérdidas económicas ocasionadas por los ophiovirus, resulta de interés comprender el proceso infectivo responsable de las enfermedades causadas por estos virus para el diseño de nuevas estrategias que ayuden a controlar su diseminación. En este trabajo de tesis, se realizó un análisis exhaustivo de la secuencia y la predicción de estructura secundaria, junto con estudios funcionales sobre las MPs de esta familia de virus segmentados negativos. Se encontró que la MP de los ophiovirus es un miembro aislado de la superfamilia 30K, con una organización estructural única. En los ophiovirus, el ácido aspártico conservado dentro de este dominio es necesario para aumentar el tamaño límite de exclusión molecular de los plasmodesmos, para mantener su capacidad NCAP y para dirigir el movimiento célula a célula de un vector viral de TMV deficiente en tal movimiento. Además, hemos logrado identificar otros posibles dominios y motivos funcionales presentes en la MP de CPsV, involucrados tanto en su localización subcelular como en su actividad como proteína de movimiento viral. Así, se encontró una NLS_BP funcional entre los aminoácidos 255 y 271, y la presencia de una posible señal de localización en plasmodesmos y de un péptido de tránsito a cloroplastos, ambos presentes en la región amino terminal de la MP. Encontramos que la región C-terminal es necesaria para que la proteína conserve la actividad proteasa, sin embargo, no sería necesaria para la función de movimiento célula a célula de la MP. Los ensayos de movimiento sistémico con virus híbridos, nos permitieron mostrar las primeras evidencias que afirman la idea de que el transporte sistémico de los ophiovirus estaría regulado por sus MP. Por ensayos de coinmunoprecipitación, hemos logrado identificar un número importante de proteínas de la planta que estarían interaccionando con la MP de CPsV. Por búsqueda bibliográfica, se encontró que un alto porcentaje de éstas participan en el transporte celular de macromoléculas y en las distintas etapas de expresión génica. También se identificaron una cantidad significativa de chaperonas, de proteínas asociadas con la respuesta frente a patógenos y hormonas, y de proteínas del sistema ubiquitina-proteasoma. Por último, se confirmó la localización de la proteína 24K en nucléolo, Cajal bodies, microtúbulos y posiblemente D-bodies. Por medio de un análisis bioinformático, seguido del correspondiente análisis mutacional, se encontró la presencia de una posible señal de exportación nuclear que sería requerida para la correcta localización nucleolar de la proteína. Además, se encontró un posible motivo WG/GW de unión a la proteína argonauta que sería necesario para la localización de 24K en D-bodies. La región carboxilo terminal sería requerida para la acumulación de la proteína en nucléolo, mientras que la región amino terminal estaría involucrada en la acumulación de la proteína en agregados en nucleoplasma.