scholarly journals DETECTION OF CRYPTOSPORIDIUM SPP. IN CALVES THROUGH NESTED PCR AND KINYOUN’S ACID-FAST METHODS IN VAN, TURKEY

2020 ◽  
Vol 10 (2) ◽  
pp. 271-276
Author(s):  
Adnan Ayan ◽  
◽  
Ozlem Orunc Kilinc ◽  
Nazmi Yuksek ◽  
Yildiray Basbugan ◽  
...  
Keyword(s):  
Nested Pcr ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
Fast Methods

scholarly journals Caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em criações comerciais brasileiras de coelhos

2016 ◽  
Vol 68 (4) ◽  
pp. 977-982
Author(s):  
M.M. Heker ◽  
A.A. Nakamura ◽  
M.V. Meireles
Keyword(s):  
Nested Pcr ◽  
Rio De Janeiro ◽  
18S Rrna ◽  
Rio Grande ◽  
Minas Gerais ◽  
Sao Paulo ◽  
Rio Grande Do Sul ◽  
Mato Grosso ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
Mato Grosso Do Sul

RESUMO A criptosporidiose é uma importante zoonose que pode ser transmitida por meio de alimentos, água de bebida e por contato com animais e pessoas infectadas. Além disso, trata-se de uma enfermidade clínica ou subclínica frequente em diversas espécies de animais, incluindo coelhos domésticos. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de Cryptosporidium spp., realizar sua classificação molecular e relacionar a presença do parasito às diferentes fases de criação em 21 criações comerciais de coelhos, localizadas nos estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Pernambuco, Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo. Quinhentas e catorze amostras de fezes foram colhidas e armazenadas em solução de dicromato de potássio 5%. Os oocistos foram purificados por centrífugo-flutuação em solução de Sheather e visualizados por microscopia, utilizando-se a coloração negativa com verde malaquita. Cinquenta e cinco amostras foram submetidas à reação em cadeia pela polimerase (nested PCR) e ao sequenciamento de fragmentos amplificados, referentes aos genes da subunidade 18S do rRNA e da glicloproteína GP60, visando à caracterização molecular de Cryptosporidium spp. Oito amostras foram positivas para Cryptosporidium spp. pela microscopia (1,56%; 8/514) e sete foram positivas pela nested PCR (12,73%; 7/55). Pela análise molecular, foi possível identificar Cryptosporidium cuniculus (18S rRNA) e C. cuniculus subtipo VbA21 (gp60) em coelhos jovens e em matrizes.

scholarly journals INFECÇÃO NATURAL POR Cryptosporidium parvum: RELATO DE CASO (Natural infection with Cryptosporidium parvum: case report)

2020 ◽  
Vol 15 (5) ◽  
Author(s):  
Ana Paula Molinari Candeias ◽  
Karim Cristhine Pase Montagnini ◽  
Liliane Aparecida Oliveira De Paula ◽  
Ana Julia Dal Curtivo Back ◽  
Fransael Franklyn Araújo Da Silva ◽  
...  
Keyword(s):  
Case Report ◽  
Cryptosporidium Parvum ◽  
Nested Pcr ◽  
Natural Infection ◽  
Ssu Rrna ◽  
Cryptosporidium Spp

A diarreia neonatal bovina é uma doença de origem multifatorial e entre os agentes envolvidos está o Cryptosporidium parvum, que ganha destaque por ser o principal protozoário responsável por ocasionar diarreia em bezerros neonatos e possuir elevado potencial zoonótico. O presente trabalho teve como objetivo, descrever um caso de infecção natural por C. parvum em um bovino diagnosticado no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) e no Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais (DOPA) da Universidade Federal do Paraná (UFPR) – Setor Palotina. Foi atendido no Hospital Veterinário da UFPR, um bovino, fêmea, Girolando, com 10 dias de vida, e conforme o histórico, o animal foi adquirido de outra propriedade que realizava a colostragem de forma inadequada, e desde a aquisição, o animal começou a apresentar manifestações clínicas como prostração e diarreia amarelada e fétida. Realizou-se tratamento, porém sem sucesso, e o animal foi a óbito, sendo encaminhado para o LPV para a autópsia. No exame macroscópico, observou-se baixo escore corporal com discreta deposição de tecido adiposo em subcutâneo e mesentério, a mucosa oral e ocular estavam levemente pálidas e no intestino, notou-se leve distensão por conteúdo gasoso e áreas multifocais com leve quantidade de conteúdo avermelhado líquido, por vezes, amarelado e fétido. Na análise histopatológica, notou-se nos no ápice das vilosidades, a presença leve de estruturas multifocais, arredondadas, eosinofílicas, medindo entre 1 a 2µm, compatíveis com Cryptosporidium spp. Parte do conteúdo fecal foi remetido ao DOPA, onde realizou-se a análise microscópica e molecular. Para a análise microscópica, foi confeccionado esfregaço fecal com o conteúdo resultante da centrifugo sedimentação, posteriormente, corado pelo método de Ziehl-Neelsen modificado (ORTOLANI, 2000). A análise confirmou a identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. Após a análise microscópica a amostra foi submetida a clarificação, extração de DNA e nested-PCR (nPCR) (XIAO et al. 1999). Para a realização da PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) e nPCR, uma alíquota da amostra foi utilizada para a extração de DNA utilizando o Kit ChargeSwitch® gDNA Mini Tissue (Invitrogen). A região 18 SSU rRNA foi selecionada como sequência alvo para amplificação de DNA, sendo que, o amplicon esperado era de 826-864pb. A reação foi realizada com o volume final de 25μL e o produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,6%. Com o intuito de identificar a espécie envolvida na infecção, após a amostra apresentar resultado positivo na técnica de nPCR, esta foi encaminhada para o sequenciamento e, após a análise da sequência de dados obtida, foi determinado que Cryptosporidium parvum era a espécie envolvida neste caso. Desta forma, o monitoramento dos animais para a obtenção do diagnóstico precoce é de suma importância para evitar as possíveis perdas na produção animal e gerenciar o risco da transmissão para seres humanos.

scholarly journals Διερεύνηση των παραγόντων κινδύνου μόλυνσης με Cryptosporidium spp. και γενοτύπησή του σε εκτροφές μικρών μηρυκαστικών

2020 ◽  
Author(s):  
Βασιλική Παπανικολοπούλου
Keyword(s):  
Disease Control ◽  
Nested Pcr ◽  
Parasitic Diseases ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
Control And Prevention ◽  
Centers For Disease Control

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν: i) η γενοτύπηση και η ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών Cryptosporidium που εμπλέκονται στο διαρροϊκό σύνδρομο των αμνών και εριφίων και ii) η διερεύνηση των παραγόντων επικινδυνότητας της μόλυνσης με Cryptosporidium spp. σε εκτροφές μικρών μηρυκαστικών. Με σκοπό τη γενοτύπηση και την ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών του που εμπλέκονται στο διαρροϊκό σύνδρομο αμνών και εριφίων συλλέχθηκαν συνολικά 580 δείγματα κοπράνων από 65 εκτροφές μικρών μηρυκαστικών. Από αυτές, 39 (60%) ήταν εκτροφές προβάτων και 26 (40%) ήταν εκτροφές αιγών. Η μέθοδος επιλογής που εφαρμόστηκε για την ανεύρεση ωοκύστεων Cryptosporidium spp. στα δείγματα κοπράνων ήταν η τροποποιημένη Ζiehl-Neelsen (Henriksen and Pohlenz, 1981). Τα 80 πρώτα θετικά δείγματα στάλθηκαν στις Η.Π.Α. (Division of Parasitic Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 4770 Buford Highway, Atlanta, USA), όπου με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών έγινε γενοτύπηση και ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών Cryptosporidium. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι 16 δείγματα κοπράνων αμνών και 17 δείγματα κοπράνων εριφίων βρέθηκαν θετικά στην PCR για τα Cryptosporidium spp. Στη συνέχεια, με την RFLP ανάλυση ταυτοποιήθηκαν δύο διαφορετικά είδη του παρασίτου, το C. parvum σε 16 ερίφια και 16 αμνούς και το C. xiaoi σε ένα ερίφιο. Σχετικά με την ταυτοποίηση των στελεχών Cryptosporidium spp. ανευρέθησαν επτά υπότυποι C. parvum με την εξής κατανομή: IIdA15G1 (σε 8 ερίφια και 1 αμνό), IIaA20G1R1 (σε 5 αμνούς και 2 ερίφια), IIaA15G2R1 (σε 4 αμνούς και 2 ερίφια), IIdA16G1 (σε 3 αμνούς), IIdA23G1 (σε 2 ερίφια), IIaA14G2R1 (σε 1 ερίφιο) και IIdA14G2 (σε 1 ερίφιο). Σε τέσσερα θετικά δείγματα με τη μέθοδο nested PCR (από τέσσερις αμνούς και ένα ερίφιο) δεν έγινε ταυτοποίηση υπότυπων C. parvum, λόγω ανεπιτυχούς αλληλούχισης του DNA των τμημάτων που προέκυψαν από την PCR για το gp60 γονίδιο. Με σκοπό τη διερεύνηση των παραγόντων επικινδυνότητας της μόλυνσης με ωοκύστεις Cryptosporidium spp. στις εκτροφές μικρών μηρυκαστικών συντάχθηκε ένα ειδικά δομημένο ερωτηματολόγιο με στόχο τη συλλογή πληροφοριών αναφορικά με διάφορα στοιχεία των εξεταζόμενων εκτροφών (αριθμός ζώων, φυλή, διαχείριση ενηλίκων ζώων, αμνών και εριφίων, απολυμάνσεις, αποπαρασιτισμοί, κλίμα, υγρασία, ηλιοφάνεια, κ.α.). Δεδομένα συλλέχθηκαν από 59 εκτροφές μικρών μηρυκαστικών, εκ των οποίων οι 35 ήταν εκτροφές προβάτων και οι 24, εκτροφές αιγών. Ακολούθως, έγινε επιλογή 22 παραμέτρων, που θεωρήσαμε ότι μπορεί να σχετίζονται περισσότερο ως προς την επικινδυνότητα της μόλυνσης των ζώων με ωοκύστεις του παρασίτου και οι οποίες επεξεργάστηκαν στατιστικά με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 2019, έκδοση 25 (SPSS Corp., IBM, Armonk., NY, USA). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της στατιστικής επεξεργασίας οι παράγοντες επικινδυνότητας που βρέθηκαν στατιστικά σημαντικοί (p≤0,05) ως προς τη μόλυνση των ζώων με το παράσιτο στις εκτροφές μικρών μηρυκαστικών (επίπεδο εκτροφής) ήταν οι εξής: η παρουσία υδατοσυλλογών στις εκτροφές και το ποσοστό των αμνών και εριφίων με διάρροια τη στιγμή της επίσκεψης. Ειδικότερα, οι εκτροφές προβάτων και αιγών με υδατοσυλλογές είχαν 11,78 φορές περισσότερη πιθανότητα να μολυνθούν με το παράσιτο σε σχέση με τις εκτροφές που δεν είχαν υδατοσυλλογές και οι εκτροφές μικρών μηρυκαστικών όπου το ποσοστό διάρροιας για τους αμνούς και τα ερίφια ήταν μεγαλύτερο του 25% , είχαν 17,39 φορές περισσότερη πιθανότητα να μολυνθούν με το παράσιτο συγκριτικά με εκτροφές όπου το ποσοστό των αμνών και των εριφίων με διάρροια ήταν ίσο ή μικρότερο του 25%.

A DETERMINAÇÃO DE GIARDIA SP. E CRYPTOSPORIDIUM SP. EM ÁGUA E RELEVÂNCIA: REVISÃO DE LITERATURA

2021 ◽  
Author(s):  
Benílton Alves Rodrigues Júnior ◽  
Débora Pereira Gomes Prado ◽  
Hanstter Hallison Alves Rezende ◽  
Andressa Rodrigues Lopes
Keyword(s):  
Nested Pcr ◽  
Cryptosporidium Spp

Introdução: A Giardia spp. é um protozoário que causa infecções intestinais, a giardiose. O parasita é transmitido pela água ou alimentos contaminados, com seu índice de acometimento relacionado a falta de saneamento básico. O Cryptosporidium spp. é o protozoário causador da criptosporidiose, que acomete animais e humanos, sendo que seu principal veículo de transmissão é a água contaminada. Os sintomas dessas parasitoses são diarreia e cólicas abdominais. Menos frequentes são enjoo, vômito, febre e fraqueza. Objetivo: Enunciar metodologias aplicadas na determinação de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. em amostras de água e relatar a relevância desta determinação para a saúde humana. Metodologia: Trata-se de um estudo de revisão literária narrativa, no intervalo de tempo de 2011-2021, onde utilizou-se das plataformas online Google Acadêmico e Portal de periódicos CAPES/MEC, com os seguintes descritores: determinação de Giardia spp. e Cryptosporidium spp em água e qualidade da água. Resultados e discussão: A análise parasitológica de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. na água destinada ao abastecimento é de grande importância devido aos riscos para saúde pública. A determinação desses parasitas podem ser realizadas em diversas metodologias, sendo mais utilizada mundialmente o método 1623 proposto pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA), que inclui fases de concentração, separação imunomagnéticas e microscopia de imunofluorescência. Entretanto, outras metodologias também são utilizadas, como a centrifugação e leitura direta em microscópio de luz, métodos de coloração convencionais, filtração em membrana, raspagem, dissolução e floculação, além de técnicas moleculares, como PCR e Nested-PCR. Sendo que destas metodologias, o método de filtração em membranas apresenta melhor custo-benefício, pois é resistente ao cloro e promove a determinação das espécies parasitarias visto que não é possível realizar tal ação através de metodologias convencionais. Conclusão: As doenças relacionadas à contaminação hídrica é um grande problema de saúde pública no mundo, logo que a má qualidade da água resulta em uma baixa qualidade de vida e a contaminação por Giardia spp. e Cryptosporidium spp. um risco a saúde humana, contudo, a determinação precisa de tais parasitas é de uma importância extrema para que haja uma total eliminação na água distribuída à população.

scholarly journals Frequency and Molecular Identification of Cryptosporidium Species among Immunocompromised Patients Referred to Hos-pitals, Central Iran, 2015-16

2020 ◽  
Author(s):  
Shahrokh IZADI ◽  
Mohammad Ali MOHAGHEGH ◽  
Zahra GHAYOUR-NAJAFABADI ◽  
Mehdi AZAMI ◽  
Farzaneh MIRZAEI ◽  
...  
Keyword(s):  
Dna Sequences ◽  
Nested Pcr ◽  
Organ Transplant ◽  
Cross Sectional Study ◽  
Cryptosporidium Species ◽  
Rrna Gene ◽  
Immunocompromised Patients ◽  
Cross Sectional ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
Hiv Aids

Background: The purpose of this study was to determine the prevalence and genotype of Cryptosporidium spp. in different groups of immunocompromised patients admitted to the referral hospitals in center of Iran during 2015–2016. Methods: This cross-sectional study was conducted on 346 immunocompromised patients (HIV+/AIDS, Lymphoma, Leukemia and organ transplants) in referred hospitals from central parts of Iran including Isfahan, Markazi, Yazd and Chaharmahale Bakhtiari provinces. Stool samples were analyzed for Cryptosporidium species, modified Ziehl–Neelsen staining techniques followed by the semi-nested PCR and DNA sequencing methods. Results: The total rate of Cryptosporidium spp. was 3.46% (12/346) in the patients, however, the prevalence of the parasite, was 4.6% (4/87) in HIV+/AIDS patients, 3.6% (6/168) in patients with blood malignancy and 2.1% (2/91) in organ transplant recipients. The SSU rRNA gene of Cryptosporidium spp. in all microscopic-positive samples was effectively amplified by the semi-nested PCR and DNA sequences, exposed the existence of two Cryptosporidium species, including C. hominis 91.6% (11/12) and C. parvum 8.3% (1/12). Conclusion: The predominance of C. hominis in the present study may be certifies the importance of anthroponotic transmission of cryptosporidiosis in center of Iran.

Molecular Identification of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in Wild Birds in Southeastern Brazil

2021 ◽  
Vol 8 (1) ◽  
Author(s):  
da Cunha MJR ◽  
◽  
Santos ALQ ◽  
Silva MBO ◽  
dos Santos MC ◽  
...  
Keyword(s):  
Nested Pcr ◽  
Epidemiological Studies ◽  
Enterocytozoon Bieneusi ◽  
Wild Birds ◽  
Southeastern Brazil ◽  
Pcr Analysis ◽  
Aquatic Birds ◽  
Free Living ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
The Impact

Introduction: The identification of Cryptosporidium spp., Giardia spp. and Enterocytozoon bieneusi in birds is relevant since these animals can act as disseminators of these parasites to humans through environmental contamination. The aim of this study was to determine the molecular occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in wild birds in southeastern Brazil and genetically characterize the isolates obtained. Methods: A total of 256 fecal samples were collected from 172 captive and 84 free-living wild birds. The DNA extracted was subjected to nested-PCR and semi-nested PCR analysis for amplification of fragments of the 18S rDNA and gdh genes of Cryptosporidium spp. and Giardia spp., respectively. Results: With respect to Cryptosporidium spp., the overall occurrence was 3.91%. Of samples from captive wild birds, six (3.49%) were positive: two waterfowl and four non-aquatic birds. Among the samples from free-living wild birds, four (4.76%) were positive, all non-aquatic birds. Regarding Giardia spp., the overall occurrence was 3.1%. Of samples from captive wild birds, four (2.32%) were positive, all waterfowl; of the samples from free-living wild birds, four (4.76%) were positive for the parasite, all non-aquatic birds. Conclusions: The presence of C. meleagridis and G. duodenalis assemblage B suggests that epidemiological studies involving wild birds and humans are needed to better understand the impact of avian cryptosporidiosis and giardiasis on avian health and their possible implications for public health.

scholarly journals Detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) using different diagnostic methods

2018 ◽  
Vol 27 (1) ◽  
pp. 60-65 ◽  
Author(s):  
Vinícius da Silva Camargo ◽  
Bruna Nicoleti Santana ◽  
Elis Domingos Ferrari ◽  
Alex Akira Nakamura ◽  
Walter Bertequini Nagata ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Malachite Green ◽  
Real Time Pcr ◽  
Nested Pcr ◽  
18S Rrna ◽  
Diagnostic Methods ◽  
Negative Staining ◽  
Cryptosporidium Spp ◽  
Genotype Iii ◽  
Pcr Targeting

Abstract This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 fecal samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries.

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