Μοριακοί μηχανισμοί κυτταρικού επαναπρογραμματισμού
Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελετά τους μηχανισμούς ρύθμισης της επαγόμενης γονιδιακής έκφρασης ευκαρυωτικών κυττάρων σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και πιο συγκεκριμένα, την ταυτοποίηση των μοριακών διακοπτών, οι οποίοι βάση της συντονισμένης απόκρισης των κυττάρων, ελέγχουν τη λειτουργία των ενισχυτών σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους πριν και μετά από ιϊκή μόλυνση. O χαρακτηρισμός των ενισχυτών που αποκρίνονται σε ιϊκές μολύνσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα απαιτείται για την κατανόηση του συντονισμού της ανοσολογικής απόκρισης και των μοριακών χαρακτηριστικών που κυμαίνονται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων, συνενεργοποιητών, τροποποιητών και αναδιαμορφωτών της χρωματίνης μέχρι την ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων.Η έρευνά μας συνίσταται από μια πρωτοποριακή και ολιστική προσέγγιση του φαινομένου των ιϊκών μολύνσεων, η εφαρμογή της οποίας συνδυάζει όλα τα δεδομένα που προέρχονται από μια πληθώρα τεχνικών της γονιδιωματικής. Χρησιμοποιήθηκαν περισσότερες από 150 αναλύσεις των μεθόδων RNA-seq, ChIP-seq, DNaseI-seq, FAIRE-seq, STARR-seq και πολυεπίπεδων βιοπληροφορικών αναλύσεων, τα οποία έχουν ως κοινή μέθοδο ανάλυσης την τεχνολογία αλληλούχησης ευρείας κλίμακας νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS). Η σύγκριση των ρυθμιστικών προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης στη διάρκεια της μόλυνσης πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, στα επιθηλιακά κύτταρα HeLa και στα Β-λεμφοκύτταρα Namalwa, τα οποία διαμολύνθηκαν με ιό Sendai, ως περιβαλλοντικό ερέθισμα. Τα χαρακτηριστικά της χρωματίνης, το προφίλ του επιγονιδιώματος καθώς και η συμμετοχή της μεταγραφικής μηχανής σε γονιδιωματικές συντεταγμένες, όπου εδράζονται οι ενισχυτές και ένας μεγάλος αριθμός καλά χαρακτηρισμένων αντι-ιϊκών γονιδίων, έθεσαν τις βάσεις για την κατασκευή μιας "μοριακής-ψηφιακής εγκυκλοπαίδειας" των γονιδίων και των ενισχυτών. Η εγκυκλοπαίδεια χαρακτηρίζεται με υψηλή εν δυνάμει πιθανότητα να παρουσιάσει "αντι-ιϊκές ιδιότητες" και ονομάζεται ΆΤΛΑΝΤΑΣ των ιϊκών μολύνσεων (Human-ATLAS-of-Virus-Infection). Ο ΑΤΛΑΝΤΑΣ επικυρώθηκε με την εφαρμογή της μεθόδου ChIP-STARR-seq. Η πρωτοποριακή αυτή μέθοδος ευρείας κλίμακας μας επέτρεψε την ταυτόχρονη εξέταση της ιϊκά επαγόμενης ενεργότητας των πολυάριθμων περιοχών πρόσδεσης των μεταγραφικών ρυθμιστών της αντι-ιϊκής απόκρισης IRF3 και p65. Αναλύσεις βασισμένες στη συντήρηση των αλληλουχιών αποκάλυψαν ότι οι λειτουργικοί αντι-ιϊκοί ενισχυτές που περιέχουν συμπλέγματα IRF μοτίβων είναι σε μεγάλο βαθμό σταθεροί σε όλη την εξέλιξη καθώς βρίσκονται στα γονιδιώματα διαφορετικών ειδών που αντιπροσωπεύουν τα σπονδυλωτά, τα ασπόνδυλα, τα φυτά, ακόμη και μικρόβια, συμπεριλαμβανομένων των ιϊκών στελεχών. Αυτές οι απλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αποτελούν τα πρώτα παραδείγματα επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών με αρχέγονη προέλευση ρύθμισης της αντι-ιϊκής απόκρισης. Προκειμένου να μελετηθεί συστηματικά η λειτουργία των συντηρημένων αλληλουχιών από τους παραπάνω διαφορετικούς οργανισμούς σε ανθρώπινα κύτταρα, αλλά και να διαπιστωθεί αν αυτές οι αλληλουχίες παρουσιάζουν και συντηρημένη ενεργότητα ενισχυτών, προβήκαμε σε κλωνοποίηση σε φορείς STARR. Έγινε διαμόλυνση σε κύτταρα HeLa και παρακολουθήσαμε την ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση του γονίδιο αναφοράς GFP in νίνο. Αυτή είναι μία από τις λίγες φορές που οι ενισχυτές διατηρούνται συντηρημένοι σε διαφορετικά Φύλα και οι αλληλουχίες με την αρχέγονη προέλευση φαίνεται να λειτουργούν ως ρυθμιστές της ανθρώπινης επαγώγιμης γονιδιακής έκφρασης κατά την αντι-ιϊκή κυτταρική απόκριση. Με βάση όλα τα παραπάνω η ολοκλήρωση της διδακτορικής αυτής διατριβής οδηγεί στη λεπτομερέστερη παρατήρηση του μηχανισμού που χρησιμοποιούν τα ανθρώπινα κύτταρα για να αποκριθούν στη διάρκεια των ιϊκών μολύνσεων. Θέτει επίσης τις βάσεις για περαιτέρω διερεύνηση τους καθώς και στην ανακάλυψη άγνωστων ως σήμερα στοιχείων αυτής της διαδικασίας. Η αποκωδικοποίηση της ρυθμιστικής λογικής πίσω από την αναδιαμόρφωση του γονιδιώματος μετά από ιϊκή μόλυνση θα οδηγήσει σε βαθύτερη κατανόηση των βασικών αρχών οργάνωσης του γονιδιώματος και στη δυνατότητα πρόβλεψης της απόκρισης των ασθενών σε θεραπευτικές και προληπτικές αγωγές με απώτερο σκοπό στο μέλλον να εφαρμόζονται σε εξατομικευμένη βάση.