Study and characterization of enzymes and metabolic pathways involved in the decomposition of lignin and lignin-derived compounds

Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελεί μία άφθονη και ανανεώσιμη πηγή ανηγμένου άνθρακα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών τα οποία μέχρι σήμερα παράγονται από το πετρέλαιο. Στα πλαίσια ενός βιοδιυλιστηρίου δεύτερης γενιάς το λιγνινοκυτταρινούχο φυτικό υλικό υπόκειται αρχικά σε προκατεργασία προκειμένου να απομακρυνθεί η λιγνίνη και να αποκτήσουν τα υδρολυτικά ένζυμα πρόσβαση στους πολυσακχαρίτες του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Τα υδρολυτικά ένζυμα απελευθερώνουν σάκχαρα τα οποία στη συνέχεια ζυμώνονται από μικροοργανισμούς, προς παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών. Έως σήμερα, η λιγνίνη που απομακρύνεται παραμένει σε μεγάλο ποσοστό ανεκμετάλλευτη, ενώ τα μυκητιακής φύσεως υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται, έχουν αυξημένο κόστος παραγωγής και παρουσιάζουν χαμηλή σταθερότητα στις αντίξοες συνθήκες ενός βιοδιυλιστηρίου. Η χρήση βακτηρίων που διαθέτουν μεταβολικά μονοπάτια αποικοδόμησης της λιγνίνης και των παραγώγων της αλλά και η χρήση εξειδικευμένων βακτηριακών ενζύμων διάσπασης της λιγνίνης αποτελούν εναλλακτικές μεθόδους αξιοποίησης της λιγνίνης προς την κατεύθυνση της παραγωγής προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η χρήση βακτηριακών υδρολυτικών ενζύμων έχει επίσης προταθεί ως εναλλακτική της χρήσης των μυκητιακών, εξαιτίας του χαμηλότερου κόστους παραγωγής των βακτηριακών ενζύμων και της υψηλότερης σταθερότητάς τους σε υψηλές θερμοκρασίες και ακραίες τιμές pH. Ο στόχος αυτής της διατριβής είναι η ανεύρεση νέων βακτηρίων και ενζύμων με ικανότητα αποικοδόμησης της λιγνίνης, η μελέτη του μηχανισμού της βακτηριακής διάσπασης της λιγνίνης και των αρωματικών μονομερών της, και η εξεύρεση βακτηριακών ενζύμων που υδρολύουν την κυτταρίνη και τις ημικυτταρίνες. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας αναμένεται να βοηθήσουν την προσπάθεια σχεδιασμού αποτελεσματικών μικροβιακών και ενζυμικών βιοκαταλυτών και την εφαρμογή τους για την πλήρη αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Για την απομόνωση αερόβιων, μεσόφιλων βακτηρίων με ικανότητα διάσπασης των συστατικών της λιγνινοκυτταρίνης, χρησιμοποιήθηκαν πέντε επιφανειακά εδαφικά δείγματα της περιοχής Λίμνη Κεριού, από το νησί της Ζακύνθου, τα οποία προστέθηκαν σε καλλιέργειες εμπλουτισμού με μοναδικές πηγές άνθρακα και ενέργειας τη λιγνίνη organosolv, την ξυλάνη σημύδας ή την άμορφη κυτταρίνη CMC. Η περιοχή του Κεριού αποτελεί ένα ιδιαίτερο ενδιαίτημα όπου παρατηρείται εκτεταμένη αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας και κατά τόπους φυσική ανάβλυση πετρελαίου με διαπιστωμένα υψηλό ποσοστό αρωματικών υδρογονανθράκων. Από το σύνολο των πέντε εδαφικών δειγμάτων απομονώθηκαν 63 αμιγείς αποικίες, οι οποίες βάση του χαρακτηρισμού του 16S rRNA γονιδίου ανήκουν σε 24 διαφορετικά γένη. Ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων που ανήκουν στο γένος Pseudomonas απομονώθηκαν από καλλιέργειες σε λιγνίνη organosolv, και ποικίλα στελέχη που ανήκουν στα φύλα Actinobacteria, Proteobacteria, Bacilli, Sphingobacteriia και Flavobacteria απομονώθηκαν από καλλιέργειες ξυλάνης και κυτταρίνης, με κυρίαρχα τα είδη του γένους Microbacterium. Για τη μελέτη ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών σε υποστρώματα λιγνίνης παρασκευάστηκαν υδρολύματα λιγνίνης από άχυρο καλαμποκιού και σιταριού, χρησιμοποιώντας μία ήπια αλκαλική μέθοδο προκατεργασίας. Παράλληλα, εξετάστηκε η ικανότητα ανάπτυξης των στελεχών σε εμπορικά σκευάσματα λιγνίνης organosolv και kraft λιγνίνης καθώς και σε πρότυπες μονομερείς και διμερείς αρωματικές ενώσεις λιγνίνης. Σημαντικός αριθμός στελεχών αναπτύχθηκαν στα υποστρώματα λιγνίνης από προκατεργασμένα αγροτικά υπολείμματα. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν το στέλεχος Pseudomonas kilonensis ZKA7 το οποίο είναι ικανό να αναπτύσσεται σε λιγνίνη από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο καλαμποκιού και σιταριού, σε λιγνίνη organosolv, και στα αρωματικά μονομερή φερουλικό, καφεϊκό και βανιλλικό οξύ. Η ανάλυση με NMR πρωτονίων έδειξε ότι το στέλεχος αυτό επιφέρει δομικές αλλαγές στο υδρόλυμα λιγνίνης από προκατεργασμένο άχυρο καλαμποκιού, και συγκεκριμένα μείωση των κορυφών που αντιστοιχούν στα αρωματικά πρωτόνια. Επίσης, το στέλεχος Pseudomonas sp. ZKA12 είναι ικανό να μεταβολίζει μονομερή λιγνίνης τύπου G- και S-, όπως φερουλικό και συρινγκικό οξύ, και μπορεί να αποτελέσει τη βάση για το μελλοντικό σχεδιασμό ενός μικροοργανισμού που θα αποικοδομεί όλα τα δομικά συστατικά της λιγνίνης. Αρκετά στελέχη ήταν ικανά να αποικοδομούν τη CMC κυτταρίνη, την μικροκρυσταλλική κυτταρίνη Avicel και την ξυλάνη σημύδας σε αμιγείς καλλιέργειες, υποδηλώνοντας τη δράση ενδογλουκανασών, εξωγλουκανασών και ξυλανασών, ωστόσο από το σημείο αυτό και έπειτα η έρευνα επικεντρώθηκε στην μελέτη της διάσπασης της λιγνίνης. Τρία οξειδοαναγωγικά ένζυμα του στελέχους ΖΚΑ7 επιλέχθηκαν για τη διερεύνηση της λιγνινολυτικής και οξειδωτικής τους ικανότητας. Συγκεκριμένα, τα ένζυμα αυτά ήταν μία πολυοξειδάση χαλκού (Pk-CopA), μία υπεροξειδάση αποχρωματισμού χρωστικών τύπου Dyp (Pk-DypB) και μία καταλάση-υπεροξειδάση (Pk-katG). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρήχθησαν σε σύστημα υπερέκφρασης E. coli και ο καθαρισμός τους πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Η πρωτεΐνη Pk-CopA είχε χαρακτηριστικά λακκάσης και οξείδωσε τη λιγνίνη από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο, παρουσία ABTS ως ενδιάμεσου μορίου. Επίσης, εμφάνισε ικανότητα οξείδωσης των αρωματικών μονομερών φερουλικό, καφεϊκό και συρινγκικό οξύ καθώς και της κατεχόλης. Η Pk-CopA είχε ενεργότητα σε ένα μεγαλύτερο εύρος pH σε σχέση με τις περισσότερες βακτηριακές λακκάσες, και επέδειξε υψηλή σταθερότητα σε θερμοκρασίες 60-70°C, και υψηλή σταθερότητα σε αλκαλικό pH, χαρακτηριστικά που καθιστούν το ένζυμο ικανό να αξιοποιηθεί σε διεργασίες ενός βιοδιυλιστηρίου. Η πρωτεΐνη Pk-DypB εμφάνισε άριστο pH δράσης στην όξινη περιοχή, αλλά σε μεγαλύτερη τιμή σε σύγκριση με χαρακτηρισμένες υπεροξειδάσες τύπου dyp, ωστόσο, η σταθερότητά της σε υψηλές θερμοκρασίες και αλκαλικό και όξινο pH ήταν χαμηλότερη από παρόμοια ένζυμα. Υπό τις εξεταζόμενες συνθήκες, δεν ανιχνεύτηκε οξειδωτική δράση έναντι της λιγνίνης που παρασκευάστηκε από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο. Η πρωτεΐνη Pk-KatG είχε δράση καταλάσης και υπεροξειδάσης ενώ επέδειξε υψηλότερη συγγένεια και καταλυτική ικανότητα έναντι οργανικών υποστρωμάτων υπεροξειδασών , σε σχέση με το υπεροξείδιο υδρογόνου που αποτελεί φυσικό υπόστρωμα για τις καταλάσες. Η Pk-KatG οξείδωσε το πρότυπο αρωματικό υπόστρωμα syringaldazine και τη συνθετική χρωστική Remazol Brilliant Blue R, υποδηλώνοντας πιθανή λιγνινολυτική δράση του ενζύμου. Τέλος, η πρωτεομική ανάλυση του στελέχους Pseudomonas kilonensis ZKA7 έδειξε ότι τα γονίδια που εμπλέκονται σε περιφερειακά και κεντρικά μονοπάτια αποδόμησης αρωματικών μονομερών της λιγνίνης είναι μεταβολικά ενεργά και επάγονται παρουσία λιγνίνης από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο. Επίσης, η πρωτεομική ανάλυση ανέδειξε την αυξορύθμιση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεϊνικούς μεταφορείς, μεταγραφικούς παράγοντες, πρωτεΐνες απόκρισης στο οξειδωτικό στρες, οξειδωτικά ένζυμα και πρωτεΐνες άγνωστης έως τώρα λειτουργίας, των οποίων ο ρόλος αναμένεται να διερευνηθεί μέσα από περαιτέρω πειράματα.