Isolation of bacteria that degrade carbamate insecticides and characterization of the functional and ecological role of bacterial genes involved in their hydrolysis in soil

Τα συνθετικά καρβαμιδικά αποτελούν μια σημαντική ομάδα γεωργικών φαρμάκων με το oxamyl να είναι o κύριος εκπρόσωπος τους σήμερα στην αγορά εντομοκτόνων/νηματοδοκτόνων. Η μικροβιακή αποδόμηση αποτελεί μία από τις κύριες διεργασίες που ελέγχει την περιβαλλοντική τύχη του oxamyl. Παραδόξως, η μικροβιακή αποδόμηση, η οποία αρχικά θεωρήθηκε ως μια επιθυμητή διεργασία για τη μείωση των περιβαλλοντικών κινδύνων, έχει μετατραπεί σε δίκοπο μαχαίρι με την ανάπτυξη του φαινομένου της επιταχυνόμενης μικροβιακής αποδόμησης, η οποία υπό ευνοϊκές συνθήκες μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της αποτελεσματικότητας των γεωργικών φαρμάκων. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της βιοαποδόμησης στην περιβαλλοντική τύχη και στην αποτελεσματικότητα των καρβαμιδικών εντομοκτόνων που εφαρμόζονται στο έδαφος στοχεύσαμε (1) στην απομόνωση και ταυτοποίηση βακτηρίων που αποδομούν το καρβαμιδικό oxamyl και στον χαρακτηρισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στη αποδόμησή του, (2) στην διερεύνηση της οικολογίας, της κατανομής και της λειτουργίας των γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες των καρβαμιδικών σε γεωργικά εδάφη και (3) στη διερεύνηση της προέλευσης και των μηχανισμών εξέλιξης των συγκεκριμένων γονιδίων. Ως πηγή για την απομόνωση βακτηρίων που αποδομούν το oxamyl χρησιμοποιήσαμε έδαφος από μια εμπορική καλλιέργεια μπανάνας που βρίσκεται στην περιοχή της Σητείας, βορειοανατολικά της Κρήτης, στην Ελλάδα με ιστορικό προηγούμενων εφαρμογών oxamyl. Παρατηρήθηκε ταχύτατη μικροβιακή υδρόλυση του oxamyl σε oxamyl oxime στο υπό μελέτη έδαφος η οποία είναι σε συμφωνία με την μειωμένη αποτελεσματικότητα του oxamyl στον συγκεκριμένο αγρό. Επακόλουθες καλλιέργειες εμπλουτισμού εμβολιασμένες με το υπό μελέτη έδαφος οδήγησαν στην απομόνωση τεσσάρων βακτηριακών στελεχών που αποδομούν το oxamyl τα οποία ταυτοποιήθηκαν, με βάση την ανάλυση αλληλουχίας πολλαπλών γενετικών τόπων (MLSA), ως Pseudomonas. Τα απομονωθέντα βακτήρια ήταν ικανά να μεταβολίζουν το oxamyl σε oxamyl oxime το οποίο δεν μετασχηματίστηκε περαιτέρω από τα στελέχη μας σε αντίθεση με την σταδιακή του αποδόμηση του στο έδαφος. Η αποστείρωση του εδάφους είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη ανάσχεση της αποδόμησης του oxamyl oxime υποδηλώνοντας ότι ο μετασχηματισμός του ήταν βιολογικά εξαρτώμενος. Ωστόσο, οι επαναλαμβανόμενες προσπάθειες μας να απομονώσουμε βακτήρια που διασπούν το oxamyl oxime ακολουθώντας την ίδια μέθοδο εμπλουτισμένων καλλιεργειών απέτυχαν, υποδηλώνοντας ότι ο μετασχηματισμός του στο έδαφος είναι πιθανώς μια συμμεταβολική διεργασία που εκτελείται από μη εξειδικευμένα βακτήρια ή μύκητες. Όλα τα απομονωθέντα βακτηριακά στελέχη έφεραν το γονίδιο cehA που κωδικοποιεί μια καρβαμιδική υδρολάση και το οποίο δείχθηκε, μέσω μεταγραφικής ανάλυσης, να είναι υπεύθυνο για την υδρόλυση του oxamyl. Τα απομονωθέντα στελέχη μπορούσαν να χρησιμοποιούν την ομάδα του μεθυλοκαρβαμικού οξέος (που απελευθερώνεται κατά την διάρκεια της υδρόλυσης του oxamyl) ως πηγή C και N, σε συμφωνία με τα υψηλά επίπεδα ανοργανοποίησης του σημασμένου oxamyl με 14C στο καρβαμικό τμήμα από όλα τα στελέχη, και την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μεθυλαμίνη, η οποία ελευθερώνεται από την διάσπαση της ασταθούς ομάδας του μεθυλοκαρβαμικού οξέος. Επεκτείναμε τις έρευνές μας από την in vitro βακτηριακή υδρόλυση του oxamyl στο ρόλο της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους στην in situ βιοδιάσπαση των καρβαμιδικών στο έδαφος. Μελετήσαμε την διάσπαση του oxamyl και καθορίσαμε την αφθονία των τριών πιο μελετημένων γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες καρβαμιδικών cehA, mcd και cahA σε 16 εδάφη από μια περιοχή μονοκαλλιέργειας πατάτας στην Ελλάδα, όπου το oxamyl χρησιμοποιείται συχνά. Το oxamyl έδειξε χαμηλή υπολειμματικότητα (DT50 = 2.4-26.7 ημέρες) και μέσω qPCR ανιχνεύσαμε τα γονίδια cehA και mcd σε 10 και 3 από τα εδάφη που μελετήθηκαν, αντίστοιχα. Η αφθονία του cehA γονιδίου εμφάνισε σημαντική θετική συσχέτιση με το pH, ενώ και η αφθονία του cehA και το pH εμφάνισαν σημαντική αρνητική συσχέτιση με το DT50 του oxamyl. Λαμβάνοντας υπόψη την ανίχνευση του mcd στα μελετούμενα εδάφη, παρά την απουσία του carbofuran, του κυριότερου υποστρώματός του, του οποίου η χρήση έχει απαγορευθεί και δεν χρησιμοποιήθηκε στην υπό μελέτη περιοχή τουλάχιστον τα τελευταία 10 έτη, εξετάσαμε την υπόθεση ότι άλλα καρβαμιδικά που χρησιμοποιήθηκαν στη περιοχή θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως υποστρώματα για το mcd. Κανένα από τα εναλλακτικά καρβαμιδικά που δοκιμάστηκαν δεν οδήγησε σε αύξηση της αφθονίας των γονιδίων cehA και mcd εκτός από (i) το oxamyl το οποίο προκάλεσε αύξηση της αφθονίας και της έκφρασης μόνο του cehA γονιδίου και (ii) το carbofuran που οδήγησε σε αύξηση της αφθονίας και της έκφρασης και των δύο γονιδίων υποδηλώνοντας έναν ενδιαφέρον καταβολικό λειτουργικό πλεονασμό ο οποίος αναφέρεται πρώτη φορά για καρβαμιδικά εντομοκτόνα εδάφους. Το cehA γονίδιο ανιχνεύθηκε επίσης σε μη γεωργικά εδάφη (που δεν είχαν εκτεθεί ποτέ σε συνθετικά καρβαμιδικά) μετά από επαναλαμβανόμενες εφαρμογές oxamyl και carbofuran και μόνο σε εδάφη με pH ≥ 7.2, όπου παρατηρήθηκε η πιο ταχεία αποδόμηση του oxamyl. Η ύπαρξη του γονιδίου cehA σε γεωργικά που έχουν εκτεθεί σε συνθετικά καρβαμιδικά εντομοκτόνα και σε μη γεωργικά εδάφη που δεν έχουν εκτεθεί σε συνθετικά καρβαμιδικά υποδεικνύει την ευρεία κατανομή του συγκεκριμένου γονιδίου που θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα ενός παράλληλου εξελικτικού μηχανισμού από έναν κοινό πρόγονο, πιθανότατα εμπλεκόμενου στην αποτοξικοποίηση φυσικών καρβαμιδικών ενώσεων που παράγονται στο έδαφος από μικροοργανισμούς και φυτά. Συνολικά, μελετήσαμε την αποδόμηση του oxamyl από βακτήρια που έχουν την ικανότητα να διασπούν το oxamyl και την μικροβιακή αποδόμηση του σε εδάφη. Αναφέραμε την απομόνωση και την ταυτοποίηση τεσσάρων στελεχών Pseudomonas με την ικανότητα να αποδομούν το oxamyl και προσδιορίσαμε το μονοπάτι του μικροβιακού μετασχηματισμού του oxamyl. Όλα τα στελέχη έφεραν το γονίδιο cehA το οποίο δείχθηκε να είναι υπεύθυνο για την υδρόλυση του oxamyl. Περαιτέρω μελέτες σε δείγματα εδάφους επιβεβαίωσαν το ρόλο του γονιδίου cehA στη διάσπαση του oxamyl, ενώ και τα δύο γονίδια cehΑ και mcd εμπλέκονται στην αποδόμηση του carbofuran. H ανίχνευση του γονιδίου cehA σε γεωργικά και μη γεωργικά εδάφη, μετά από εφαρμογή oxamyl υποδηλώνει την ευρεία εμφάνισή του και τονίζει τον σημαντικό ρόλο του pH στην κατανομή του cehA στα εδάφη. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναμένεται να έχουν σημαντικές συνέπειες σχετικά με την διατήρηση γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες καρβαμιδικών σε εδάφη, έχουν πρακτικές εφαρμογές σχετικά με την γεωργική χρήση των καρβαμιδικών και παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη του γονιδίου cehA.