Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου

2018 ◽  
Author(s):  
Βασίλειος Λάζαρης
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Real Time Pcr ◽  
Matrix Attachment Region ◽  
Initiation Of Replication ◽  
Attachment Region

Η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια θεραπευτική παρέμβαση στην οποία το φάρμακο είναι DNA ή RNA (διαγονίδιο) και υπόσχεται ίαση σε μια σειρά μονογονιδιακών ασθενειών και κακοηθειών. Η γονιδιακή μεταφορά του επιθυμητού διαγονιδίου επιτυγχάνεται με την χρήση φορέων κυρίως ιϊκών που καλούνται να υπερκεράσουν τους φυσικούς φραγμούς και να καθοδηγήσουν το γονίδιο στο πυρήνα του κυττάρου. Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν μια εναλλακτική προσέγγιση στους ήδη καθιερωμένους ιϊκούς φορείς κυρίως στο ότι δεν ενσωματώνονται στο DNA των κυττάρων. Οι φορείς αυτοί τελευταία στηρίζονται στην ύπαρξη μιας χρωμοσωμικής αλληλουχίας που ονομάζεται S/MAR (scaffold/ matrix attachment region) για την συγκράτηση τους στον πυρήνα του κυττάρου. Περαιτέρω, ο συνδυασμός της αλληλουχίας S/MAR με ένα ακόμα χρωμοσωμικό στοιχείο το IR (Initiation of replication) φαίνεται να βελτιώνει τις ιδιότητες του φορέα σε κυτταρικές σειρές και σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Στην παρούσα διατριβή δημιουργήσαμε ένα νέο φορέα (pEPI-IR/β-globin) ο οποίος φέρει ως διαγονίδιο το γονίδιο της β-σφαιρίνης της αιμοσφαιρίνης του ανθρώπου, τις ρυθμιστικές αλληλουχίες αυτού αλλά και τις δύο χρωμοσωμικές αλληλουχίες S/MAR και IR. Mελετήσαμε την λειτουργικότητα του φορέα αυτού και προσδιορίστηκε ότι ο φορέας pEPI-IR/β-globin μπορεί να διαμολύνει επιτυχώς κύτταρα της αιματολογικής κυτταρικής σειράς Κ562 με την διαδικασία της nucleofection. Είναι σε θέση να εγκαταστήσει σταθερή διαμόλυνση στα κύτταρα αυτά και να ανιχνεύεται μετά από τουλάχιστον 100 γενεές (σε 1,3 αντίγραφα ανά κύτταρο), ενώ κατά το διάστημα αυτό διατηρεί την επισωματική του κατάσταση. Διατηρείται η λειτουργικότητα της κασέτας του γονιδίου της β-σφαιρίνης και η έκφραση του ανιχνεύεται τόσο σε επίπεδο mRNA με real-time PCR όσο και σε επίπεδο πεπτιδίου με ανοσοφθορισμό in situ. Συμπερασματικά ο pEPI-IR/β-globin αποτελεί έναν νέο επισωματικό φορέα ο οποίος είναι λειτουργικός σε κύτταρα Κ562 και μπορεί να αποτελέσει την βάση ανάπτυξης επισωματικών φορέων της β-σφαιρίνης για περαιτέρω πειράματα για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας θαλασσαιμικών συνδρόμων.

Development of a real-time PCR assay for the detection of Trichinella spiralis in situ

2009 ◽  
Vol 161 (1-2) ◽  
pp. 92-98 ◽  
Author(s):  
H. Atterby ◽  
J. Learmount ◽  
C. Conyers ◽  
I. Zimmer ◽  
N. Boonham ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Real Time Pcr ◽  
Trichinella Spiralis ◽  
Pcr Assay

scholarly journals Comparison of the sensitivity and specificity of real-time PCR and in situ hybridization in HPV16 and 18 detection in archival cervical cancer specimens

2012 ◽  
Vol 50 (2) ◽  
pp. 239-247 ◽  
Author(s):  
Beata Biesaga ◽  
Sława Szostek ◽  
Małgorzata Klimek ◽  
Jerzy Jakubowicz ◽  
Joanna Wysocka
Keyword(s):  
Cervical Cancer ◽  
Real Time ◽  
Sensitivity And Specificity ◽  
Real Time Pcr

scholarly journals Fluorophores from fungi

2003 ◽  
Vol 24 (3) ◽  
pp. 12 ◽  
Author(s):  
Duncan Veal ◽  
Philip Bell ◽  
Hayley Brown ◽  
Hung-Yoon Choi ◽  
Peter Karuso
Keyword(s):  
Nucleic Acid ◽  
Real Time ◽  
Dna Microarray ◽  
Differential Display ◽  
Real Time Pcr ◽  
In Situ Hybridisation ◽  
Analytical Techniques ◽  
Fluorescence In Situ Hybridisation

Fluorescence has many advantages over traditional colour and radioactive labels, and is playing an increasingly important role in the most powerful analytical techniques. For example, fluorescence is at the heart of many nucleic acid based diagnostics (e.g. DNA microarray, real time-PCR, fluorescence in situ hybridisation, etc), immunofluorescence assays, defined substrate technologies and differential display proteomics and is gradually replacing or complementing other techniques based on colour or radiolabels.

Rapid in situ detection of virulent Vibrio vulnificus strains in raw oyster matrices using real-time PCR

2009 ◽  
Vol 2 (1) ◽  
pp. 76-80 ◽  
Author(s):  
Craig Baker-Austin ◽  
Anthony Gore ◽  
James D. Oliver ◽  
Rachel Rangdale ◽  
J Vaun McArthur ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Real Time Pcr ◽  
Vibrio Vulnificus ◽  
In Situ Detection

Quantification of an Eikelboom type 021N bulking event with fluorescence in situ hybridization and real-time PCR

2005 ◽  
Vol 68 (5) ◽  
pp. 695-704 ◽  
Author(s):  
Han Vervaeren ◽  
Kurt De Wilde ◽  
Jorg Matthys ◽  
Nico Boon ◽  
Lutgarde Raskin ◽  
...  
Keyword(s):  
In Situ Hybridization ◽  
Fluorescence In Situ Hybridization ◽  
Real Time ◽  
Real Time Pcr

scholarly journals OCT4B1 Regulates the Cellular Stress Response of Human Dental Pulp Cells with Inflammation

2017 ◽  
Vol 2017 ◽  
pp. 1-10 ◽  
Author(s):  
Lu Liu ◽  
Rong Huang ◽  
Ruiqi Yang ◽  
Xi Wei
Keyword(s):  
In Situ Hybridization ◽  
Survival Rate ◽  
Western Blot ◽  
Real Time ◽  
Real Time Pcr ◽  
Dental Pulp ◽  
Immunofluorescence Staining ◽  
Dental Pulp Cells ◽  
Pulp Cells

Introduction. Infection and apoptosis are combined triggers for inflammation in dental tissues. Octamer-binding transcription factor 4-B1 (OCT4B1), a novel spliced variant of OCT4 family, could respond to the cellular stress and possess antiapoptotic property. However, its specific role in dental pulpitis remains unknown. Methods. To investigate the effect of OCT4B1 on inflammation of dental pulp cells (DPCs), its expression in inflamed dental pulp tissues and DPCs was examined by in situ hybridization, real-time PCR, and FISH assay. OCT4B1 overexpressed DPCs model was established, confirmed by western blot and immunofluorescence staining, and then stimulated with Lipopolysaccharide (LPS). Apoptotic rate was determined by Hoechst/PI staining and FACS. Cell survival rate was calculated by CCK8 assay. Results. In situ hybridization, real-time PCR, and FISH assay revealed that OCT4B1 was extensively expressed in inflamed dental pulp tissues and DPCs with LPS stimulation. Western blot and immunofluorescence staining showed the expression of OCT4B1 and OCT4B increased after OCT4B1 transfection. Hoechst/PI staining and FACS demonstrated that less red/blue fluorescence was detected and apoptotic percentage decreased (3.45%) after transfection. CCK8 demonstrated that the survival rate of pCDH-OCT4B1-flag cells increased. Conclusions. OCT4B1 plays an essential role in inflammation and apoptosis of DPCs. OCT4B might operate synergistically with OCT4B1 to reduce apoptosis.

scholarly journals Aromatase is abundantly expressed by neonatal rat penis but downregulated in adulthood

2004 ◽  
Vol 33 (2) ◽  
pp. 343-359 ◽  
Author(s):  
S Jesmin ◽  
C N Mowa ◽  
I Sakuma ◽  
N Matsuda ◽  
H Togashi ◽  
...  
Keyword(s):  
Real Time ◽  
Real Time Pcr ◽  
Corpus Cavernosum ◽  
Cell Types ◽  
Neonatal Rat ◽  
Estrogen Synthesis ◽  
Aromatase Mrna ◽  
Reproductive Events ◽  
Different Cell Types

Although synthesis of estrogen by male gonads has been well documented for over half a century, it is only recently that the role of estrogen in male reproductive events has gained appreciation. We recently reported abundant expression of estrogen receptor (ER)-α and -β in different cell types of the rat penis, whose levels diminished with advancing age. The present study, which builds on data from the ER study, was designed to determine whether the penis is capable of generating its own local estrogen by examining evidence of the expression of aromatase, a microsomal enzymatic complex which irreversibly converts androgens to estrogens, using immunohistochemistry, Western blotting, in situ hybridization and real-time PCR analyses. Secondly, the effects of sex steroid hormones on penile aromatase were examined. Discrete aromatase immunoreactive cells were localized in primordial corpus cavernosum, corpus spongiosus and os penis, blood vessels and sensory corpuscle of glans penis. In situ hybridization signals corresponded with immunohistochemical findings. Western blot, enzyme immunoassay and real-time PCR analyses of rat penile samples revealed an age-dependent expression of aromatase and estrogen, with levels at week 1 almost resembling those of the ovary, but they decreased sharply by week 8, and decreased further by week 35. This expression pattern was strikingly similar to that of ER-α reported previously. Testosterone and diethylstilbesterol administered prenatally upregulate levels of aromatase mRNA and protein, and estrogen postnatally. Dihydrotestosterone upregulated aromatase mRNA and protein, but not estrogen. We conclude that estrogen acts via ER in a paracrine and/or autocrine manner to regulate penile events, particularly during development, and that estrogen synthesis is regulated by estrogen and androgens.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document