Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων φασματομετρίας κινητικότητας ιόντων για τον προσδιορισμό μεγέθους και σύστασης νανοσωματιδίων

Ως νανοσωματίδια ορίζονται υλικά των οποίων τουλάχιστον 2 διαστάσεις δεν ξεπερνούν τα 100 νανόμετρα (1-100 nm). Τα σωματίδια αυτά ταξινομούνται σε δύο κύριες κατηγορίες: τα φυσικά προϊόντα (πχ Μακρομόρια, Βιο-κολλοειδή) και τα τεχνητά κατασκευασμένα. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει εκδηλωθεί τεράστιο ενδιαφέρον για τα νανοσωματίδια καθώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ποικίλες εφαρμογές λόγω των διαφορετικών φυσικών, χημικών και βιολογικών ιδιοτήτων τους. Τα νανοσωματίδια μπορούν να χαρακτηριστούν χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές συμπεριλαμβανομένης της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, της χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους, της κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και της Φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Αντίθετα με την μεγάλη ποικιλία των διαθέσιμων τεχνικών, η ανάγκη για γρήγορες, χωρίς σήμανση και στατιστικά ισχυρές αναλύσεις παραμένει. Μεγάλος αριθμός ερευνητικών εργαστηρίων και εταιριών ασχολείται με την ανάπτυξη νέων τεχνικών αλλά κυρίως με την βελτίωση και τον συνδυασμό των ήδη υπαρχόντων. Τα τελευταία χρόνια είναι διαθέσιμη μια καινούργια συνδυαστική τεχνική που περιλαμβάνει νανο-ηλεκτροψεκασμό (nanoelectrospray: nES) συζευγμένο με φασματομετρία διαφορικού αναλυτή κινητικότητας ιόντων (ion mobility spectrometry: IMS) και ανιχνευτή μέτρησης συμπυκνωμένων σωματιδίων (condensed particle counting: CPC). Η τεχνική αυτή, σε αρκετές δημοσιεύσεις αναφέρεται ως μοριακός αναλυτής ηλεκτροφορετικής κινητικότητας αέριας φάσης (Gas-phase Electrophoretic Mobility Molecular Analyzer: GEMMA) και μέχρι στιγμής έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τον προσδιορισμό μεγέθους μακρομορίων βιολογικής προέλευσης καθώς και σε πληθώρα ανόργανων τεχνητά κατασκευασμένων νανοσωματιδίων.Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αξιολόγηση και η ανάπτυξη του GEMMA για το προσδιορισμό του μεγέθους και της στοιχειακής σύνθεσης νανοσωματιδίων. Για την επίτευξη του, αναλύθηκε μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων τα οποία απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας καθιερωμένα βιοχημικά πρωτόκολλα. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα, δύο υδροδυναμικών τεχνικών (multi-angle laser light scattering: MALLS, quasi-elastic light scattering: QELS) καθώς και με μια καλά εδραιωμένη τεχνική φασματομετρίας Μάζας (LTQ-Orbitrap). Έμφαση δόθηκε στην αξιολόγηση διάφορων αναλυτικών παράμετρων όπως ευαισθησία, ακρίβεια, επαναληψιμότητα, χρόνος μέτρησης, χρόνος ανάλυσης των δεδομένων, δείγμα που χρειάζεται και καταναλώνεται ανά μέτρηση. Επιπλέον το GEMMA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ολιγομερικής κατάστασης πρωτεΐνης με διαφορετικές σημειακές μεταλλάξεις. Επίσης αναλύθηκαν δείγματα DNA. Το πιο απαιτητικό κομμάτι αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη θεωρητικού μοντέλου για τον προσδιορισμό της αλλάγης της δομικής διαμόρφωσης του πρωτεϊνικού ομοιοπολικού συμπλόκου GFP-GBP-YFP (Fluo) με προσθήκη υποστρώματος. Η Fluo λειτουργεί ως βιοαισθητήρας γλυκόζης.Η δυναμική της τεχνικής ελέγχτηκε περαιτέρω με ανάλυση διάφορων ανόργανων νανοσωματιδίων γνωστού μεγέθους, σχήματος και συσσωματωμάτων. Η μελέτη επεκτάθηκε σε εργαστηριακά συντιθέμενα νανοσωματίδια από άνθρακα και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με μετρήσεις Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Διέλευσης (Transmission Electron Microscopy: TEM).Το βασικό μειονέκτημα αυτής της τεχνικής προκύπτει από τις δυνατότητες του ανιχνευτή συμπυκνωμένων σωματιδίων (CPC). Αυτός ο εξαιρετικά ευαίσθητος ανιχνευτής δεν παρέχει πληροφορία σχετικά με την στοιχειακή σύσταση των νανοσωματιδίων που ανιχνεύει. Σε μια προσπάθεια να ξεπεραστεί αυτή η αδυναμία, έγινε off-line σύζευξη του nES-DMA με Φασματομετρία επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry: ICP-MS) σε λειτουργία ανίχνευσης μεμονωμένων σωματιδίων (single particle mode,SPM). Με τον τρόπο αυτό επιτεύχθηκε ο προσδιορισμός τόσο του μεγέθους όσο και της στοιχειακής σύστασης νανοσωματιδίων σε μια μόνο μέτρηση. Οι προσπάθειες εστιάστηκαν, επίσης, στη βελτιστοποίηση της λειτουργίας της GEMMA. Έτσι προσαρμόστηκαν 4 διαφορετικοί τριχοειδείς σωλήνες στην μονάδα ηλεκτροψεκασμού και προσδιορίστηκαν οι αποδοτικότερες συνθήκες λειτουργίας (π.χ ροή, αγωγιμότητα κ.λ.π).Οι κύριοι άξονες της παρούσας μελέτης μπορούν να συνοψιστούν: 1) στην κατανόηση και έλεγχο της δυνατότητας προσδιορισμού των ιδιοτήτων βιομορίων (μέγεθος, σχήμα, ολιγομερισμός και σχετική μοριακή μάζα) που απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν, χρησιμοποιώντας καθιερωμένα εργαστηριακά πρωτόκολλα, 2) στον έλεγχο των δυνατοτήτων της ως προς τον χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων (μέγεθος, σχήμα ολιγομερισμός, σύσταση) ανόργανων νανοσωματιδίων, και 3) στην βελτίωση της τεχνικής (σύζευξη με άλλους ανιχνευτές, αλλαγές στην οργανολογία) για την εξάλειψη των μειονεκτημάτων της και την διεύρυνση των δυνατοτήτων της. Οι πειραματικές προσεγγίσεις για την επίτευξη του σκοπού της διδακτορικής διατριβής διαφαίνεται με μεγαλύτερη λεπτομέρεια στο σχήμα 1.των μειονεκτημάτων της και την διεύρυνση των δυνατοτήτων της.