A Fluorometric Approach to Studying the Effects of Ionic Strength on Reaction Rates: An Undergraduate Steady-State Fluorescence Laboratory Experiment

2003 ◽  
Vol 80 (10) ◽  
pp. 1191 ◽  
Author(s):  
Stephen W. Bigger ◽  
Peter J. Watkins ◽  
Bruce Verity
Keyword(s):  
Steady State ◽  
Ionic Strength ◽  
Laboratory Experiment ◽  
Reaction Rates ◽  
Steady State Fluorescence

Spectroscopic Studies of Asparaginyl-tRNA Synthetase from Entamoeba histolytica

2019 ◽  
Vol 26 (6) ◽  
pp. 435-448
Author(s):  
Priyanka Biswas ◽  
Dillip K. Sahu ◽  
Kalyanasis Sahu ◽  
Rajat Banerjee
Keyword(s):  
Circular Dichroism ◽  
Steady State ◽  
Entamoeba Histolytica ◽  
Protein Concentration ◽  
Trna Synthetase ◽  
Solvent Exposure ◽  
Steady State Fluorescence ◽  
State Process ◽  
Wide Range ◽  
Circular Dichroïsm

Background: Aminoacyl-tRNA synthetases play an important role in catalyzing the first step in protein synthesis by attaching the appropriate amino acid to its cognate tRNA which then transported to the growing polypeptide chain. Asparaginyl-tRNA Synthetase (AsnRS) from Brugia malayi, Leishmania major, Thermus thermophilus, Trypanosoma brucei have been shown to play an important role in survival and pathogenesis. Entamoeba histolytica (Ehis) is an anaerobic eukaryotic pathogen that infects the large intestines of humans. It is a major cause of dysentery and has the potential to cause life-threatening abscesses in the liver and other organs making it the second leading cause of parasitic death after malaria. Ehis-AsnRS has not been studied in detail, except the crystal structure determined at 3 Å resolution showing that it is primarily α-helical and dimeric. It is a homodimer, with each 52 kDa monomer consisting of 451 amino acids. It has a relatively short N-terminal as compared to its human and yeast counterparts. Objective: Our study focusses to understand certain structural characteristics of Ehis-AsnRS using biophysical tools to decipher the thermodynamics of unfolding and its binding properties. Methods: Ehis-AsnRS was cloned and expressed in E. coli BL21DE3 cells. Protein purification was performed using Ni-NTA affinity chromatography, following which the protein was used for biophysical studies. Various techniques such as steady-state fluorescence, quenching, circular dichroism, differential scanning fluorimetry, isothermal calorimetry and fluorescence lifetime studies were employed for the conformational characterization of Ehis-AsnRS. Protein concentration for far-UV and near-UV circular dichroism experiments was 8 µM and 20 µM respectively, while 4 µM protein was used for the rest of the experiments. Results: The present study revealed that Ehis-AsnRS undergoes unfolding when subjected to increasing concentration of GdnHCl and the process is reversible. With increasing temperature, it retains its structural compactness up to 45ºC before it unfolds. Steady-state fluorescence, circular dichroism and hydrophobic dye binding experiments cumulatively suggest that Ehis-AsnRS undergoes a two-state transition during unfolding. Shifting of the transition mid-point with increasing protein concentration further illustrate that dissociation and unfolding processes are coupled indicating the absence of any detectable folded monomer. Conclusion: This article indicates that GdnHCl induced denaturation of Ehis-AsnRS is a two – state process and does not involve any intermediate; unfolding occurs directly from native dimer to unfolded monomer. The solvent exposure of the tryptophan residues is biphasic, indicating selective quenching. Ehis-AsnRS also exhibits a structural as well as functional stability over a wide range of pH.

Associative Behaviors of a Novel Series of Amphiphilic Statistical Tripolymers

2014 ◽  
Vol 472 ◽  
pp. 603-606
Author(s):  
Xu Wu ◽  
Hong Hua Xiao ◽  
Ji Juan Wang ◽  
Xiao Xuan Xie ◽  
Jia Wei Lin ◽  
...  
Keyword(s):  
Steady State ◽  
Self Assembly ◽  
Sulfonic Acid ◽  
The Self ◽  
Steady State Fluorescence

A novel series of brush-like amphiphilic statistical tripolymers were designed and prepared by polymerization of amphiphilic macromonomer 2-(acrylamido)-dodecane sulfonic acid (AMC12S, 10 to 90 mol %), with hindrance units sodium p-styrenesulfonate (SSS, 0 to 5 mol %), and 2-(acrylamido)- 2-methylpro-panesulfonic acid (AMPS). The self-assembly behaviors of these tripolymers were investigated using steady-state fluorescence, and the increase of amphiphilic units results in a decrease of microdomain polarity and polymer concentrations for assembly, while the increase of hindrance units leads little change of microdomain polarity.

scholarly journals Φωτοδυναμική μελέτη ισομερισμού παραγώγων του ναφθαλενίου σε ομογενή και υπερμοριακά συστήματα

2010 ◽  
Author(s):  
Ιωάννα Μπαλωμένου
Keyword(s):  
Energy Transfer ◽  
Steady State ◽  
Fluorescence Spectroscopy ◽  
Visible Spectroscopy ◽  
Time Resolved ◽  
Steady State Fluorescence ◽  
Uv Visible ◽  
Steady State Fluorescence Spectroscopy

Στην παρούσα διατριβή, στόχος ήταν η μελέτη της αντίδρασης ισομερισμού οργανικών μορίων τα οποία εμφανίζουν παρόμοια συμπεριφορά με αντίστοιχα βιομόρια που συμμετέχουν σε σημαντικές διεργασίες στα βιολογικά συστήματα, όπως οι πρωτεΐνες. Τα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υποκατεστημένα ναφθαλένια, τα οποία παρουσιάζουν ένα ιδιαίτερο τύπο ισομερισμού μεταξύ ετεροατόμων και όχι αμιγών διπλών δεσμών. Αρχικά μελετήθηκαν τα εμπορικά διαθέσιμα μόρια 2-μεθοξυναφθαλένιο (2-MeONp) και 2,6-διμεθοξυναφθαλένιο (2,6-DiMeONp), ενώ στη συνέχεια συντέθηκε εργαστηριακά το διυποκατεστημένο (κεντροσυμμετρικά) ναφθαλένιο με αλυσίδες μεθοξυ-τριαιθυλενογλυκόλης 2,6-DiΤegNp. Τα μόρια αυτά μπορούν να υπάρχουν σε διακριτά στερεοϊσομερή με cis και trans διαμορφώσεις, οι οποίες διαφέρουν σημαντικά, τόσο στην ενέργεια όσο και στη στερεοδιάταξη της αλκόξυ ομάδας που είναι ενωμένη με το ναφθαλενικό δακτύλιο. Οι πειραματικές μετρήσεις ενισχύθηκαν περαιτέρω με θεωρητικούς υπολογισμούς. Στο πρώτο στάδιο, έγινε εκτενής φασματοσκοπική ανάλυση με Φασματοσκοπία Ορατού – Υπεριώδους (UV - Visible Spectroscopy), Φασματοσκοπία Φθορισμού Στατικής Κατάστασης (Steady State Fluorescence Spectroscopy) και Χρονικά Αναλελυμένη Φασματοσκοπία Εκπομπής (Time - Resolved Emission Spectroscopy:TRES), σε οργανικούς διαλύτες διαφορετικής πολικότητας και ιξώδους, (π.χ 3-μέθυλοπεντάνιο, δεκατετράνιο, 2-μέθυλοτετραϋδροφουράνιο), επιτυγχάνοντας ακριβή διαχωρισμό των φωτοδυναμικών ιδιοτήτων του κάθε ισομερούς. Κατά συνέπεια, προσδιορίστηκαν πειραματικά, αλλά και με θεωρητικούς υπολογισμούς, οι κύριες θερμοδυναμικές και κινητικές παράμετροι της αντίδρασης του ισομερισμού στη βασική και στη διεγερμένη κατάσταση. Αποδείχτηκε λοιπόν, ότι στη βασική κατάσταση, το 2-μεθοξυναφθαλένιο υπάρχει σε δύο διαφορετικές φασματικά διακεκριμένες διαμορφώσεις cis και trans, με την ισορροπία να ευνοεί την cis μορφή. Όμως, σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από 260Κ, στη διεγερμένη κατάσταση, τα δύο ισομερή μπορούν να αλληλομετατρέπονται, ισοενεργειακά, με στρέψη γύρω από το CAryl-O "διπλό" δεσμό περίπου 1800, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός αεναή φωτοδυναμικού κύκλου. Αντίστοιχα, τα δυο διυποκατεστημένα μόρια, 2,6-διμεθοξυναφθαλένιο και 2,6-DiTegNp βρίσκονται σε δύο διαμορφώσεις, cis,cis και cis,trans, στο διάλυμα. Σε Τ>260Κ οι δύο ισομερείς μορφές αλληλομετατρέπονται κατά τη διάρκεια της ζωής τους στην διεγερμένη κατάσταση, με την ισορροπία να ευνοεί την πιο ασταθή cis,trans μορφή. Επίσης, φαίνεται να μην υπάρχει καμία αλλαγή στις κινητικές και θερμοδυναμικές παραμέτρους των δύο διυποκατεστημένων μορίων, ανεξάρτητα από το μέγεθος της υποκατεστημένης αλυσίδας και το είδος του διαλύτη. Η παραπάνω παρατήρηση οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το “sp2” υβριδισμένο άτομο οξυγόνου, το οποίο βρίσκεται συνδεδεμένο με τον ναφθαλενικό δακτύλιο, θα πρέπει να αναστρέφεται αδιαβατικά μεταξύ των δύο επίπεδων διαμορφώσεων (syn, φ≈00 και anti, φ≈1800). Δηλαδή, πραγματοποιείται μια ταυτόχρονη φωτοχημική εναλλαγή των δύο γειτονικών δεσμών, σε αντίθεση με ότι είναι μέχρι τώρα αποδεκτό για παρόμοια συστήματα. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η φωτοδραστική συμπεριφορά των διαφορετικών διαμορφώσεων του 2,6-DiΤegNp στη στερεά κατάσταση. Η ανάλυση της δομής του κρυστάλλου με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ έδειξε ότι κυριαρχεί η cis,cis μορφή. Ωστόσο η φασματοσκοπική μελέτη αποκάλυψε την ύπαρξη ενός πολύ μικρού ποσοστού του θερμοδυναμικά ασταθέστερου ισομερούς trans,trans, παγιδευμένο στο κρυσταλλικό πλέγμα της cis,cis μορφής. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι οι δύο αυτοί πληθυσμοί, δηλαδή οι cis,cis και trans,trans, δεν μεταβάλλουν τα σχετικά ποσοστά τους θερμικά στη κρυσταλλική κατάσταση. Με άλλα λόγια, οι δύο μορφές δεν εξισορροπούνται θερμικά ωστόσο με τήξη του κρυσταλλικού φιλμ και αργή επαναφορά σε θερμοκρασία δωματίου, η τηγμένη φάση «ξεκλειδώνει» τη φαινομενικά παγωμένη θερμικά ισορροπία cis,cis σε trans,trans. Η διαδικασία αυτή, που λαμβάνει χώρα στη βασική κατάσταση, διέπεται πιθανώς από ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει περιστροφή του ναφθαλενικού πυρήνα (rotator) γύρω από τους δύο ψεύδοδιπλούς δεσμούς CAryl-O κατά φ ≈ 1800, ενώ οι στερικά παρεμποδισμένες ολιγομερικές αλυσίδες παραμένουν σταθερές. Αντίθετα, στη διεγερμένη κατάσταση, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία, λόγω του πυκνού πακεταρίσματος είναι αδύνατη η οποια πιθανή στερεοχημική φωτοεπαγόμενη αναδιάταξη του μορίου. Ωστόσο, λόγω της πολύ κοντινής απόστασης των χρωμοφόρων εκδηλώνεται πολύ γρήγορη μετανάστευση ενέργειας διεγέρσεως (energy transfer) δια μέσου των χρωμοφόρων του κρυσταλλικού πλέγματος. Όταν η ενέργεια αυτή καταλήξει στο χαμηλότερης ενέργειας ισομερές trans,trans* (*: διεγερμένη μορφή) τότε η διάδοση σταματά και εκδηλώνεται φθορισμός από την μορφή αυτή. Τέλος, μελετήθηκε η συμπεριφορά του ισομερισμού των παραπάνω μορίων μέσα σε υπερμοριακές νανοδομές, χρησιμοποιώντας ως υποδοχείς τις υδατοδιαλυτές φυσικές κυκλοδεξτρίνες, (α,β,γ), επειδή προσφέρουν καθορισμένο και ρυθμιζόμενο μέγεθος κοιλότητας. Τα αποτελέσματα της μελέτης των συμπλόκων, με τις παραπάνω φασματοσκοπικές τεχνικές σε συνδυασμό με τη φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), έδειξαν αρχικά ότι τα 2-μεθοξυναφθαλένιο και 2,6-διμεθοξυναφθαλένιο δεν εμφανίζουν ιδαίτερη συμπεριφορά σε μείγματα με β- και γ- κυκλοδεξτρίνες, ωστόσο, η μικρότερη κοιλότητα της α-κυκλοδεξτρίνης είναι ικανή να απομονώσει και να σταθεροποιήσει τις ασταθείς ενεργειακά trans και trans,trans διαμορφώσεις, αντίστοιχα. Όσον αφορά το πιο περίπλοκο δομικά 2,6-DiTegNp, αν και φαίνεται να εμφανίζει μία σύνθετη συμπεριφορά στις α- και γ- κυκλοδεξτρίνες, αντίθετα, ο εγκλωβισμός της cis,cis μορφής του στη κοιλότητα της β- κυκλοδεξτρίνης φαίνεται να ευνοεί ένα μηχανισμό ισομερείωσης μεταξύ των cis,cis και trans,trans μορφών, στη διεγερμένη κατάσταση, παρόμοιο με τη συμπεριφορά που παρατηρήθηκε στη κρυσταλλική φάση για τη βασική κατάσταση.

scholarly journals Mechanism of a Disassembly Driven Sensing System Studied by Stopped-Flow Kinetics

2021 ◽  
Author(s):  
Cara Gallo ◽  
Suma S. Thomas ◽  
Allison Selinger ◽  
Fraser Hof ◽  
Cornelia Bohne
Keyword(s):  
Steady State ◽  
Rate Constants ◽  
Artificial Saliva ◽  
Global Analysis ◽  
Dissociation Rate ◽  
Stopped Flow ◽  
Steady State Fluorescence ◽  
Saliva Analysis ◽  
Binding Isotherms ◽  
Dissociation Rate Constants

<div> Mechanistic studies were carried out on the kinetics for the assembly of a DimerDye (DD12) and the binding of the monomeric DimerDye (DD1) with nicotine in aqueous buffer and artificial saliva. DD12 is non-fluorescent, while monomeric DD1 and DD1-nicotine fluoresce. Binding isotherms were determined from steady-state fluorescence experiments. The report includes measurements of the steady-state fluorescence at pHs 2.2, 6.3 and 12.1, and stopped-flow kinetic data for the homodimerization forming DD12 and DD1-nicotine formation in buffer and artificial saliva. Analysis of the homodimerization kinetics led to the recovery of the association and dissociation rate constants for DD12. These rate constants were used in the global analysis for the coupled kinetics for DD1-nicotine formation, which led to the determination of the association and dissociation rate constants for nicotine binding to DD1.</div>

scholarly journals Effect of Nedocromil Sodium on Polymorphonuclear Leukocyte Plasma Membrane

1994 ◽  
Vol 3 (7) ◽  
pp. S21-S24 ◽  
Author(s):  
A. Kantar ◽  
N. Oggiano ◽  
P. L. Giorgi ◽  
G. V. Coppa ◽  
R. Gabbianelli ◽  
...  
Keyword(s):  
Plasma Membrane ◽  
Steady State ◽  
Membrane Fluidity ◽  
Fluorescence Anisotropy ◽  
Polymorphonuclear Leukocyte ◽  
Polymorphonuclear Leukocytes ◽  
Plasma Membranes ◽  
Nedocromil Sodium ◽  
Plasma Membrane Fluidity ◽  
Steady State Fluorescence

The effect of nedocromil sodium on the plasma membrane fluidity of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) was investigated by measuring steady-state fluorescence anisotropy of 1-[4-trimethylammonium-phenyl]-6-phenyl- 1,3,5-hexatriene (TMA-DPH) incorporated in the membrane. Our results show that nedocromil sodium 300 μM significantly decreased membrane fluidity of PMNs. The decrease in membrane fluidity of PMNs induced by fMLP was abolished in the presence of nedocromil sodium. These data suggest that nedocromil sodium interferes with the plasma membranes of PMNs and modulates their activities.

Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document